Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Bakterien Haftungseigenschaften zu verleihen, um ihre Trennung aus flüssigen Medien zu erleichtern. Dies wird erreicht, indem zunächst ein synthetisches Curli konstruiert wird, um die komplexe genetische Regulation zu umgehen und die einfache sowie massive Produktion klebriger Polymere zu ermöglichen. Im zweiten Schritt werden haftende Bakterien auf Polystyrol visualisiert und quantifiziert, was eine schnelle Abschätzung der Effizienz der synthetischen Vorrichtung ermöglicht.

Anschließend werden adhärente Bakterien auf Glas mittels konfokaler Mikroskopie visualisiert. Um den Biofilm direkt beobachten und Informationen über seine Struktur gewinnen zu können, werden Ergebnisse erhalten, die eine signifikante Zunahme der Adhärenz bei dem Stamm zeigen, der die synthetische Vorrichtung trägt, basierend sowohl auf Adhärenz- als auch prozentualen Messungen sowie mikroskopischen Beobachtungen. Der Hauptvorteil des synthetischen Biologie-Ansatzes gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Klonierung besteht darin, dass Konstrukte, die nur die absolut notwendigen Gene mit geeigneten Signalen enthalten, sehr schnell erhalten werden können.

Diese Methode kann helfen, eine zentrale Fragestellung im Bereich der Bioremediation zu beantworten, beispielsweise die Herausforderung, metallbelastete Bakterien aus radioaktivem Abfall zu entfernen. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da Grundkenntnisse über genetische Regulationsignale und den Umgang mit Datenbanken erforderlich sind. Die visuelle Demonstration wird sich auf die Quantifizierung und Visualisierung von Biofilmen konzentrieren, da diese beiden Schritte aufgrund der Zerbrechlichkeit der Biofilme besonders schwer zu erlernen sind.

Der erste Schritt bei der Konstruktion des synthetischen Carrons besteht darin, die genetische Organisation der Curly-Gene zu bestimmen und ihre endogenen transkriptionellen sowie translationsellen Signale zu lokalisieren. Dies wird mithilfe spezialisierter Datenbanken wie REON DB oder EcoGene durchgeführt. Im nächsten Schritt werden die fünf unbedingt erforderlichen Gene für die Curly-Synthese ausgewählt: CSGB und CSGA kodieren für die Faser-Monomere, während C-S-G-E-C-S-G-F und CSGG den für das Curly-Sekretionssystem notwendigen Komplex kodieren. Die ausgewählten Sequenzen werden aus der Datenbank im FASTA-Format extrahiert. Anschließend erfolgen die Datenverwaltung und eine in silico-Voranalyse mit der Clone-Manager-Software, da der C-S-G-G-F-E-Cluster im Escherichia-coli-Genom antisense orientiert ist.

Diese Sequenz muss in ihr komplementäres Gegenstück umgewandelt werden. Verwenden Sie die Klon-Manager-Werkzeuge, wählen Sie die Funktion „Molekül invertieren“ und fügen Sie die C-S-G-E-F-G-Sequenz mithilfe der Funktion „Ligieren“ hinter C-S-G-B-A ein. Fügen Sie anschließend den geeigneten Promotor PRCN vor der C-S-G-B-A-E-F-G-iCal-Sequenz hinzu.

Das RCN-Locus kodiert eine FLX-Pumpe, RCNA, die für die Entgiftung von Nickel und Cobalt verantwortlich ist, sowie ihren zugehörigen Metallregulator RCNR. In Abwesenheit von Cobalt oder Nickel bindet der Repressor RCNR an die RCNR-Box auf der DNA und verhindert die vollständige transkriptionelle Aktivierung der downstream gelegenen Gene. Steigt die intrazelluläre Konzentration von Cobalt oder Nickel an, so verhindert die Bindung von Cobalt oder Nickel an das RCNR-Protein die Fixierung des Repressors an den Promotor, wodurch die transkriptionelle Aktivität von P-R-C-N-A zunimmt und die fünf ausgewählten curly Gene unter die Kontrolle des Promotors gestellt werden.

Es wird vorhergesagt, dass PRCN curly in Gegenwart von Kobalt und Nickel überproduziert werden. Anschließend optimieren Sie die transkriptionellen Signale, indem Sie eine perfekte Ribosomenbindungsstelle oder RBS vor dem ersten ATG der CS-gba-DNA-Sequenz und eine zweite perfekte RBS vor der C-S-G-E-F-G-Sequenz hinzufügen. Um den I-GM-Standards zu entsprechen, muss das Bauteil durch ein standardmäßiges Bio-Brick-Präfix, das Restriktionsstellen für ECO R one und X-bar one enthält, sowie durch ein Suffix, das Restriktionsstellen für SPE one und PST one enthält, flankiert sein, um eine weitere Zusammenführung zu erleichtern.

Die Bio-Brick-Sequenz selbst darf keine Erkennungsstellen für EcoRI, PstI, SpeI und XbaI enthalten. Daher wurden diese Stellen durch stille Mutationen entfernt. Eine in silico Restriktionsanalyse des Konstrukts zeigte je eine PstI-Stelle in der CSGA-Sequenz, eine PstI-Stelle in der RCNR-Sequenz und eine EcoRI-Stelle im CSGE-Gen auf. Diese Stellen wurden durch stille Mutationen modifiziert.

Nach Abschluss des Designs des synthetischen Opor führen Sie eine Übersetzungssimulation mit der Clone-Manager-Software durch. Verwenden Sie das Sequenzalignierungsprogramm Blast, um eine perfekte Homologie zwischen den Wildtyp-Curly-Proteinen und den von dem synthetischen On kodierten Proteinen zu überprüfen, um dieses Verfahren für jede Vertiefung einer 24-Loch-Polystyrolplatte mit zwei Milliliter M63-Minimalmedium mit 0,2 % Glukose zu beginnen. Inokulieren Sie jede Vertiefung mit 106 Zellen einer Übernachtkultur von Bakterien. Kultivieren Sie die Bakterien 18 bis 48 Stunden bei 30 Grad Celsius ohne Schütteln. Jede Spalte der 24-Lochplatte repräsentiert eine Modalität.

Bei Bedarf wird die geeignete Menge an Kobalt und Antibiotikum zugegeben. Die ersten drei Reihen dienen zur Quantifizierung der adhärenten Bakterien A durch Mittelwertbildung aus den drei Wiederholungen. Die letzte verbleibende Reihe wird verwendet, um den Biofilm nach 18 bis 48 Stunden mittels Kristallviolett-Färbung sichtbar zu machen; anschließend wird der Überstand, der die planktischen Zellen aus jedem der ersten drei Reihen der 24-Loch-Platte enthält, abgenommen und in ein Hämolyseröhrchen überführt.

Spülen Sie jedes Loch vorsichtig mit einem Milliliter M-63-Medium und ziehen Sie die Waschflüssigkeit mit der anfänglichen Überstandfraktion in das Hämolyseröhrchen auf. Dieser Pool wird als schwimmende Zellen bezeichnet und mit S gekennzeichnet. Der Boden der Löcher in der Mikrotiterplatte ist mit adhärenten Zellen bedeckt. Um den Biofilm zu gewinnen, geben Sie je ein Milliliter M-63-Medium hinzu.

Gründlich mit der Pipettenspitze abkratzen, dann mehrmals auf- und abpipettieren und die Biofilmmenge in ein neues Hämolyseröhrchen überführen. Das Röhrchen 15 Sekunden lang verwirbeln. Die Biofilmmenge in Hämolyseröhrchen sammeln.

Dieser Pool repräsentiert die an der Oberfläche anhaftenden Zellen, bezeichnet als B. Übertragen Sie 200 Mikroliter der Überstände und Biofilm-Fraktion aus den Hämolyse-Röhrchen in eine 96-Well-Platte. Schätzen Sie die Anzahl der an der Oberfläche anhaftenden und schwimmenden Bakterien anhand der optischen Dichte bei 600 Nanometern. Der Prozentsatz der Adhärenz für jede Modalität wird mithilfe der Formel B mal 100 geteilt durch drei mal S plus B berechnet. Um den Biofilm nur für die letzte Reihe der 24-Well-Platte sichtbar zu machen, entfernen Sie die planktonischen Zellen aus diesen Vertiefungen.

Geben Sie ein Milliliter M 63 in jede Vertiefung, um den Biofilm, der sich auf dem Boden der Platte gebildet hat, abzuwaschen. Trocknen Sie die unbedeckte Platte eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius. Danach geben Sie 100 Mikroliter 20 % Kristallviolett in jede Vertiefung, gefolgt von ausgiebigen Waschungen mit Wasser. Für dieses Protokoll wird ein fluoreszierendes Chassis benötigt.

Ein geeigneter Wirt für das Plasmid, das den synthetischen Curli trägt, ist der E. coli SCC1-Stamm, der grün fluoreszierendes Protein konstitutiv exprimiert, ohne beobachtbare Unterschiede zum Elternstamm MG1655. Transformieren Sie den Wirtsstamm mit einem PUCK57-Plasmid, das den synthetischen Curli trägt, um den S23-Stamm zu erhalten. Transformieren Sie den Wirtsstamm mit einem Kontrollplasmid, PUCK18, um den Kontrollstamm zu erhalten.

Züchten Sie die Stämme S 23 und S 24 über Nacht bei 30 Grad Celsius in M-63-Medium, ergänzt mit Glukose und Ampicillin, um Vorkulturen anzulegen. Geben Sie am folgenden Tag 20 Milliliter M-63-Medium in eine Petrischale und impfen Sie 15 Milliliter M-63 in Petrischalen mit jeweils 100 Mikrolitern der Vorkulturen an. Fügen Sie die geeignete Konzentration an Kobalt hinzu und vergessen Sie nicht die negative Kontrolle ohne Kobalt.

Führen Sie drei rechteckige Glasdeckgläser in jede Petrischale ein. Inkubieren Sie die Schalen über Nacht bei 30 Grad Celsius ohne Schütteln. Die Bakterien können an den folgenden Tagen direkt im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Es ist wichtig, das Trocknen der Probe zu vermeiden, daher müssen die folgenden Schritte sorgfältig, aber schnell durchgeführt werden. Entfernen Sie jede Deckglasabdeckung aus den Petrischalen und lassen Sie sie vorsichtig abtropfen. Reinigen Sie die Unterseite vorsichtig mit einem kleinen Wattestäbchen, das mit 70 % Ethanol getränkt ist, um alle bakteriellen Rückstände für die konfokale Beobachtung zu entfernen.

Legen Sie die Deckglasplatte mit der oberen Fläche, auf der sich der Biofilm befindet, nach oben zeigend auf einen Objektträger. Der Biofilm wird anschließend mit einem größeren Deckglas abgedeckt, das mit Lack am Objektträger befestigt wird.

Drehen Sie die Vorrichtung um, sodass sich der Biofilm nun auf der unteren Seite befindet. Platzieren Sie die Vorrichtung in diesem Experiment unter dem konfokalen Laser-Mikroskop. Ein Zeiss LSM five 10 meta konfokales Laser-Mikroskop wird innerhalb der CT-Micro-Plattform verwendet.

Wählen Sie das 40-fache Öl-Immersion-Objektiv aus. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Erregen Sie GFP bei 488 Nanometern und detektieren Sie die bakterielle Fluoreszenz im Bereich von 500 bis 600 Nanometern. Nutzen Sie das 40-fache Öl-Immersion-Objektiv zur Aufnahme der Bilder.

Im laser-scanning-konfokalen Modus. Scannen Sie die gesamten dreidimensionalen Strukturen der Biofilme von der festen Oberfläche bis zur Grenzfläche mit dem Wachstumsmedium, wobei ein Schritt von einem Mikrometer verwendet wird.

Führen Sie dreidimensionale Projektionen mit einer Maus-Software durch und bestimmen Sie die Biofilmdicke durch Analyse des durchschnittlichen C-Werts entlang statistischer Längsschnitte. Die Quantifizierung des Biofilms sowie die Bestimmung der Biovolumina kann aus konfokalen Z-Stapeln gewonnen werden. Die Adhärensfähigkeiten von E. coli, die so konstruiert wurden, dass sie als Reaktion auf Metall Curli überproduzieren, können mittels einfacher Methoden beurteilt werden.

Beispielsweise ermöglicht die Färbung mit Kristallviolett in 24-Well-Polierplatten vom Typ Irene eine schnelle Visualisierung der Biofilmbildung am Boden jedes Wells, wie der Unterschied in der Intensität der violetten Färbung zeigt. Es scheint, dass der Wildtyp-Stamm weniger haftend ist als der gentechnisch veränderte Stamm. Eine quantitative Methode besteht darin, die Adhärenzprozentsätze des Wildtyps und der gentechnisch veränderten Stämme auf Polystyrol bei verschiedenen Kobaltkonzentrationen zu messen.

Die in diesem Diagramm dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Adhärenzprozentzahl des konstruierten Stammes um das 1,5-Fache höher ist als die des Wildtyp-Stammes in Abwesenheit von Kobalt. Zusätzlich wurde eine signifikante Verstärkung der Adhärenz bei steigenden Kobaltkonzentrationen beobachtet; in Medien mit Kobaltkonzentrationen von 25 Mikromolar oder 50 Mikromolar erreichen die Adhärenzprozentzahlen der konstruierten Zellen jeweils 30 % und 40 %. Die Adhärenzfähigkeiten können auch mittels Mikroskopie verglichen werden, wobei GFP-markierte Bakterien auf Objektträgern kultiviert werden. Beobachtungen mittels Epifluoreszenzmikroskopie von grünen Bakterien vor schwarzem Hintergrund zeigen, dass der konstruierte Stamm einen Biofilm bildet, während der Wildtyp-Stamm lediglich Mikrokolonien ausbildet, wie durch die Pfeile angezeigt.

Die Analyse mittels konfokaler Mikroskopie liefert einen Gesamtüberblick über die dreidimensionale Struktur des Biofilms. Draufsicht-Rekonstruktionen sind in den Feldern A dargestellt, Seitenansicht-Rekonstruktionen in den Feldern B. Die Ergebnisse bestätigen, dass der konstruierte Stamm stärker haftet und einen dichteren und dickeren Biofilm bildet als der Wildtyp. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Versuchsdesign sorgfältig zu überprüfen, beispielsweise um das Bioremediationspotenzial modifizierter E. coli oder Occus-Ameisen im Kontext radioaktiver Abwässer zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen synthetischen Genabschnitt mit Clone-Manager-Software entwirft und wie man die Expression bakterieller Stämme schnell quantifizieren kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit synthetischen Genen und genetisch veränderten Organismen äußerst gefährlich sein kann. Sie müssen gemäß den geltenden Gesetzen behandelt werden, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Autoklavieren transformierter Bakterien sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.