Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen gewünschten DNA-Konstrukt an einer vorbestimmten Stelle in das bakterielle Chromosom einzufügen. Dies wird durch ein Kopulationsprotokoll erreicht, das vier genetisch veränderte Bakterienstämme umfasst. Der Empfängerstamm weist eine „Landing-Pad“-Sequenz auf, die aus einem Spektinomycin-Resistenzgen und dem e coli beta-Glucuronidase-Gen, flankiert von ATP-Sequenzen, besteht und in sein Chromosom integriert ist.

Der P JH one 10-Spenderstamm trägt ein Plasmid mit B-Stellen, die ein „Stuffer“-Gen für ein rotes fluoreszierendes Protein flankieren, sowie ein Antibiotikaresistenzgen. Der PJC two-Spenderstamm trägt ein Plasmid, das die sequenzspezifische Integrase des Streptomyces-Phagen C 31 unter Kontrolle des LAC-Promotors enthält. Der vierte Stamm MT 616 stellt die für die Konjugation erforderlichen Transfergene bereit, die den Plasmidtransfer von Zelle zu Zelle ermöglichen und zur Bildung von Transkonjuganten in den Empfängerstämmen führen.

Erwerb der beiden Plasmide, die für den integrasenvermittelten Kassettenaustausch erforderlich sind. Der Austausch der Donorkassette aus dem PJ H one 10-Plasmid gegen die Marker der Landeplatzkassette auf dem Chromosom führt zum Verlust der Landeplatz-Marker SPR und UIDA sowie zur Beibehaltung der Donorkassette RFP und GMR im resultierenden transformierten Organismus. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Verfahren wie der homologen Rekombination liegt in der Einfachheit und Effizienz des Protokolls.

Es ist außerdem auf eine breite Palette von Bakterien übertragbar. Der Akzeptorstamm, der in diesem Video verwendet wird, ist ein S. milli-Latex-Stamm, der zwei Tage vor dem Konjugationsverfahren zur Erzeugung von Trans-Integrinen aus einer einzelnen Kolonie in fünf Milliliter TY-Medium mit Spektinomycin angeimpft wird. Inkubieren Sie den S. milli-Stamm zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Am Tag vor dem Konjugationsverfahren impfen Sie jeden der folgenden E. coli-Stämme in jeweils fünf Milliliter flüssiges LB-Medium, das mit dem jeweils geeigneten Antibiotikum ergänzt ist: DH5α, der das Integrations-Expressionsplasmid trägt, in Medium mit Tetracyclin; MT616, den Mobilisierer-Intermediär, in Medium mit Chloramphenicol; und DH5α, der das Donor-Kassettenplasmid trägt, in Medium mit Gentamycin. Inkubieren Sie die drei E. coli-Stämme über Nacht bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln, um die Zellen für das Konjugationsverfahren vorzubereiten. Übertragen Sie jeweils 1,5 Milliliter der vier Kulturen in ein Reaktionsröhrchen und zentrifugieren Sie bei 17.000 × g für 30 Sekunden, um das Zellpellet zu gewinnen. Entsorgen Sie das Medium und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in einem Milliliter steriler 0,85 %iger Natriumchloridlösung. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut, nachdem Sie den Überstand abdekantiert haben. Resuspendieren Sie jedes Pellet in 100 Mikroliter steriler 0,85 %iger Natriumchloridlösung mithilfe einer Pipette. Geben Sie jeweils 10 Mikroliter der gewaschenen Kultur für jeden Stamm punktförmig auf eine reine TY-Agarplatte.

Diese Stellen sind Kontrollstellen. Geben Sie anschließend 40 Mikroliter jeder Stammprobe mit Ausnahme von E. coli DH5α, das PJC2 enthält, in ein steriles Reagenzglas und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Tragen Sie 120 Mikroliter dieser Mischung auf die reine TY-Agarplatte auf. Diese Stelle dient als negative Kontrolle ohne Integrationsenzym.

Fügen Sie abschließend jeweils 40 µL der vier Stämme in ein steriles Reagenzglas hinzu, mischen Sie gründlich und pipettieren Sie 160 µL dieses Gemischs auf dieselbe TDY-Agarplatte. Dieser Fleck ist der Integrations-vermittelte Kassettenaustausch-Kreuzungsfleck.

Stellen Sie die Platte in eine laminare Luftströmungsabsaugung und lassen Sie die Auftragestellen etwa 20 Minuten trocknen. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie am Tag nach dem Befruchtungsstrich über Nacht bei 30 Grad Celsius. Die beiden Kontrollstellen und die IMCE-Befruchtungsstelle auf TY-Agar-Platten, die mit Streptomycin und Gentamycin ergänzt wurden.

Der S-milli-Akzeptorstamm trägt eine Mutation, die eine hohe Resistenz gegen Streptomycin vermittelt, zur Berechnung der IMCE-Effizienz. Resuspendieren Sie ungefähr ein Viertel des IMCE-Matingspots in 500 Mikrolitern steriler 0,85 %iger Natriumchloridlösung. Erstellen Sie zehnfache serielle Verdünnungen bis 10 hoch minus sieben. Impfen Sie Verdünnungen von 10 hoch minus zwei bis 10 hoch minus fünf auf TY-Agarplatten, die mit Streptomycin, Gentamycin und Xgl ergänzt sind, um Trans-Immigranten auszuwählen. Impfen Sie Verdünnungen von 10 hoch minus drei bis 10 hoch minus sieben auf TY-Agarplatten, die mit Streptomycin und Xgl ergänzt sind, um sowohl Trans-Immigranten als auch potenzielle Rezipienten auszuwählen. Inkubieren Sie die Platten für insgesamt Rezipienten bei 30 Grad Celsius für drei Tage.

Beobachten Sie RFP-trans unter grünem Licht und durch einen roten Filter; berechnen Sie die prozentuale IMCE-Effizienz als CFU der trans-immigrierten Zellen im Vergleich zur CFU der gesamten Empfängerzellen. Etwa die Hälfte der Transkonjuganten sollte nach drei Tagen Inkubation auf Ty, ergänzt mit Streptomycin und Gentamycin, einen echten Austausch durchlaufen haben, wodurch sie weiß und resistent werden. Bei den folgenden Kontrollstämmen sollte kein Wachstum auftreten: Kontrolle ohne Integrise, s. millilaté UW227, Kontrolle E. coli MT616, Kontrolle E. coli DH5α, das pJH110 enthält, sowie Kontrolle E. coli DH5α, das pJC2 enthält. Im Gegensatz dazu sollte der IMCE-Abstrich von der Konjugationsstelle dichtes Wachstum auf dem ersten Abstrich (head streak) und zahlreiche Kolonien auf dem zweiten Abstrich aufweisen. Diese beiden nächsten Bilder zeigen Re-suspendierungen einer 10⁻²-Verdünnung der Konjugationsstelle auf TY-Streptomycin-Xgl-Agar sowie auf TY-Streptomycin-Gentamycin-Xgl-Agar.

Die blauen Kolonien sind einzelne Rekombinanten. Während die weißen Kolonien Trans-Integrine darstellen, die einen echten Kassettenaustausch durchlaufen haben, zeigen diese bei Betrachtung unter grünem Licht und durch einen roten Filter eine Tendenz zur negativen zwei Verdünnung der Mating-Spot-Resus-Suspension auf TY-Streptomycin-Cin-Xgl-Agar, die keine Fluoreszenz aufweist. Im Gegensatz dazu zeigt die 10 zur minus zwei Verdünnung der Mating-Spot-Resus-Suspension auf Ty-Streptomycin-Gentamycin-Xgl-Agar zwei Fluoreszenzniveaus.

Die helleren Kolonien entsprechen blauen Kolonien und weisen einen höheren RFP-Ausdruck auf, vermutlich aufgrund einer Leseleitung von dem LAC-Promotor im Vektor. Die weniger hellen Kolonien entsprechen weißen Kolonien, bei denen ein echter Kassettenaustausch stattgefunden hat, sodass das RFP nur unter Kontrolle seines unmittelbaren Promotors vorliegt und kein Leseleitung vom LAC-Promotor erfolgt. Diese Kolonien sollten außerdem empfindlich gegenüber Spektinomycin sein.

Die Effizienz der trans-Integration, ausgedrückt als Prozentsatz der trans-Immigranten an der Gesamtanzahl der Empfänger, sollte im Bereich von 0,5 % liegen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bakterielle Konjugation unter Verwendung unserer konstruierten Stämme nutzt, um DNA-Konstrukte in das bakterielle Chromosom einzufügen.