Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von "Safety-Catch"-Methodik

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein funktionalisiertes BSP-Peptid mithilfe von Festphasentechniken zu synthetisieren. Dies wird erreicht, indem eine geschützte BIS-Aminosäure auf Harz aus Hydroxyethylbenzoesäure aufgeladen wird. Anschließend werden mehrfach Tiefenschutz-Kupplungszyklen durchgeführt, um funktionalisierte BIS-Aminosäuren anzufügen, ein Vorgang, der das BIS-Peptid verlängert und die gewünschte Funktionalität darstellt.

Schließlich wird die erste bis-Aminosäure mit einer alpha-Aminosäure modifiziert, um das BIS-Peptid durch Bildung eines DI-Keto-Pyrazins von dem Harz abzuspalten. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Synthese eines funktionalisierten BSP-Peptids in guter Rohreinheit und konsistenten isolierten Ausbeuten von etwa 10 %, basierend auf der Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. Die Bedeutung dieser Methode reicht bis zur parallelen und Bibliothekssynthese von bis-Peptiden, da die BIS-Peptide an einem festen Harz aufgebaut werden, was eine einfachere Handhabung im Vergleich zu Reaktionen in Lösung ermöglicht, und Nebenprodukte leicht durch Filtration entfernt werden können.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da viele der Schritte schwer zu erlernen sind, weil zahlreiche wichtige Details beachtet werden müssen, um sicherzustellen, dass alle Reaktionen so vollständig wie möglich ablaufen. Bei der Festphasensynthese gibt es keine Möglichkeit, Zwischenprodukte zu reinigen. Daher muss jede Reaktion so weit wie möglich vorangetrieben werden, um ein reines Endprodukt zu erhalten.

Es wird empfohlen, eine Checkliste der experimentellen Verfahren anzulegen, um Verwechslungen zu vermeiden, da die Schritte von repetitiver Natur sind. Dieses Protokoll beginnt mit dem Beladen mit dem ersten BSP-Peptid, dem Schutz des ersten BSP-Peptids und dem gleichzeitigen Kappen des Harzes. Zum Starten des Ladevorgangs für das erste BSP-Peptid werden 114 Milligramm H-M-B-A-A-Harz in ein acht Milliliter fassendes Reaktionsgefäß eingewogen und ein magnetischer Rührstab hinzugefügt.

Verschließen Sie die Oberseite des Gefäßes mit dem Gummiseptum und spülen Sie das Rohr mindestens fünf Minuten lang mit Argon durch. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die aktivierte BIS-Aminosäurelösung gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Übertragen Sie die Lösung, wie in diesem Video gezeigt, mithilfe einer Spritze in das Reaktionsgefäß und rühren Sie über Nacht unter Argon. Am folgenden Tag entfernen Sie das Septum und lassen die Reaktionsmischung ab.

Spülen Sie das Harz, indem Sie etwa zwei Milliliter Chloromethan zum Harz geben. Rühren Sie 30 Sekunden bis eine Minute und lassen Sie es dann ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal mit DCM und spülen Sie das Harz anschließend fünfmal mit Dimethylformamid.

Um einen tiefen Schutz der ersten bis-aminosäure und gleichzeitiges Abdecken des Harzes durchzuführen, langsam zwei Milliliter einer Lösung von 33 % Bromwasserstoffsäure in Essigsäure und DCM zum Reaktionsgefäß geben. Nach dem Abtrennen und fünfmaligem Waschen des Harzes mit DCM 15 Minuten unter Rühren belassen. Die D-Schutzsequenz einmal erneut wiederholen.

Als Nächstes wird das Harz fünfmal mit DCM und anschließend fünfmal mit DMF gewaschen. Das Harz wird durch zweimaliges Waschen mit einer 5 %igen (Volumen/Volumen) Lösung von D-I-P-E-A in DMF neutralisiert. Danach erfolgt erneut eine fünfmalige Behandlung mit DCM und fünfmaliges Waschen mit DMF. Nun kann die Kopplung der geschützten, funktionalisierten bis-Aminosäure durchgeführt werden.

Zuerst wird eine inerte Atmosphäre in das Harz enthaltende Reaktionsgefäß wiederhergestellt, indem dieses dreimal mit wasserfreiem DCM gewaschen wird. Anschließend wird ein Septum angebracht und das Gefäß über eine Argongasleitung gespült und gewaschen, indem ein bis zwei Milliliter wasserfreies DCM zugegeben und 30 Sekunden gerührt werden. Danach wird das Gefäß abgelassen, bis der Blasenzähler an der Argongasleitung zu steigen beginnt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens einmal erneut. Bereiten Sie anschließend eine Lösung der funktionalisierten bis-Aminosäure in einem im Flammbrenner getrockneten Reagenzglas unter Argon-Atmosphäre vor. Geben Sie 47 µL DIC zu und rühren Sie 90 Minuten lang.

Fügen Sie dann 35 Mikroliter D-I-P-E-A in 666 Mikrolitern und Hydrus-DMF zur Harzphase hinzu und rühren Sie weitere fünf Minuten. Überführen Sie die voraktivierte BIS-Aminosäurelösung mittels Spritze in das Reaktionsgefäß und rühren Sie über Nacht am folgenden Tag. Entfernen Sie das Reaktionsgemisch und waschen Sie zweimal mit wasserfreiem DCM unter Argonatmosphäre.

Ein kritischer Schritt bei diesem Verfahren sind die Biz-Aminosäurekupplungen. Um die Bildung von Diketopiperazin-Ringen sicherzustellen, verwenden wir längere Reaktionszeiten mit zusätzlichen Aktivierungsmitteln. Um die Schließung des Diketopyrazins zu fördern, geben Sie eine HOAT- und DIC-Lösung hinzu und rühren eine Stunde unter Argon.

Entfernen Sie anschließend die Septum und lassen Sie das Reaktionsgemisch ab. Waschen Sie das Harz fünfmal mit DCM und fünfmal mit DMF. Dieser Abschnitt behandelt den tiefen Schutz der funktionalisierten BIS-Aminosäure, den tiefen Schutz von F moc sowie die Acylierung der ersten BIS-Aminosäure.

Um einen tiefen Schutz der geschützten funktionalisierten Bis-Aminosäure durchzuführen, langsam zwei Milliliter einer Lösung aus TFA und TIPS zum Reaktionsgefäß geben und nach dem Abtrennen eine Stunde lang umrühren, das Harz etwa 30 Sekunden lang mit DCM waschen und dann abtrennen; diesen DCM-Waschschritt fünfmal wiederholen. Anschließend die gesamte Sequenz zur tiefen Schutzgruppenentfernung am Harz nach dem Waschschema A-D-C-M-D-M-F erneut durchführen. Das Harz durch zweimaliges Waschen mit einer 5 %igen (Volumen/Volumen) Lösung von D-I-P-E-A in DMF neutralisieren.

Führen Sie anschließend eine weitere D-C-M-D-M-F-Waschung durch. Ab diesem Punkt kann das BIS-Peptid mit anderen funktionalisierten bis-Aminosäuren verlängert oder an der führenden Stickstoff-Carbonsäure funktionalisiert werden, oder beides. Um die FM-Gruppe abzuspalten, geben Sie eine zwei Milliliter Lösung mit 20 % Piperidin in DMF zu und mischen die Reaktion 20 Minuten lang.

Das Harz fünfmal mit DMF abgießen und waschen. Diesen Vorgang nach einem zusätzlichen Waschschritt des Harzes noch einmal wiederholen. Isolieren Sie das erste bis-Aminosäure-Derivat, indem Sie die hergestellte Aminosäurelösung dem Reaktionsgefäß hinzufügen und als letzten Schritt sechs Stunden lang umrühren.

Waschen Sie das Harz fünfmal mit DCM und fünfmal mit DMF. Der letzte Abschnitt dieses Protokolls umfasst die Entfernung der Bach-Gruppe vom harzgebundenen Aminosäure und die Abspaltung vom Harz. Geben Sie zunächst zwei Milliliter einer 1:1-TFA-DCM-Lösung zum Reaktionsgefäß und rühren Sie 30 Minuten lang.

Das Harz fünfmal mit DCM ablassen und waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend noch einmal. Waschen und ablassen Sie das Harz 30 Sekunden lang jeweils fünfmal mit DCM und fünfmal mit DMF.

Fügen Sie anschließend zwei Milliliter einer Lösung von 10% D-I-P-E-A in wasserfreiem DMF hinzu und rühren Sie 24 bis 48 Stunden lang um. Sammeln Sie abschließend das Reaktionsgemisch in einem vorher gewogenen Rundkolben. Überführen Sie 30 Mikroliter dieser Lösung in 450 Mikroliter Tetrahydro-FU in einer LC-MS-Datei und reichen Sie diese zur Analyse ein.

Waschen Sie das Harz mit weiteren Portionen von DMF und sammeln Sie es im Rundkolben. Zur Überwachung chemischer Umsetzungen am Harz während der Synthese können die folgenden Methoden eingesetzt werden. Um freie Hydroxylgruppen nachzuweisen, führen Sie den Methylrot-Test durch, indem Sie zunächst etwa ein Milligramm trockenes Harz mit einer Einwegpipette entnehmen.

Spülen Sie in ein vier Milliliter fassendes Reaktionsgefäß. Geben Sie eine wie im Text beschriebene Methylrot-Lösung hinzu und rühren Sie fünf bis 10 Minuten lang um. Entfernen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie das Harz fünfmal mit DCM. Orange oder rote Harzperlen weisen auf das Vorhandensein freier Hydroxylgruppen hin.

Dieser Test kann verwendet werden, um die Beladung der ersten bis-aminosäure und die Harzabsperrungsschritte zu überprüfen. Um sekundäre Aminogruppen nachzuweisen, führen Sie den Chlortest durch: Überführen Sie etwa ein Milligramm trockenes Harz mittels Einwegpipette in ein kleines Gefäß. Geben Sie drei Tropfen der 0,8 Millimolar-Chlortlösung in DMF sowie drei Tropfen der 2 %igen Aldehydlösung in DMF hinzu.

Und lassen Sie uns bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten warten. In diesem Fall deuten blaue oder violette Harzperlen darauf hin, dass freie sekundäre Aminogruppen an der Harz-gebundenen Verbindung vorhanden sind. Um die Aktivierungseffizienz zu bestätigen, kann während der Synthese ein Aktivierungs-Trap-Test durchgeführt werden, bei dem fünf bis zehn Mikroliter der aktivierten Lösung in ein Fläschchen für die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie überführt werden, das 50 Mikroliter Olain enthält, und manuell gemischt wird.

Für einige Sekunden sollte die Lösung gelb werden, dann mit 450 µL Tetrahydrofuran verdünnen und zur LC-MS-Analyse einreichen. Das Endprodukt und die aktivierten Zwischenprodukte können mithilfe eines LC-MS-Systems mit einer C18-Rückgrat-Säule und einem Lösungsmittelsystem aus Wasser/Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure analysiert werden. Diese LC-MS-UV-Chromatogrammspur zeigt ein Beispiel für die gute Reinheit des Rohprodukts.

Die Hauptspitze im Spektrum bei 21,3 Minuten weist eine Maske auf, die mit der erwarteten Produktmasse übereinstimmt. Dies lässt sich im Massenspektrum des Rohprodukts veranschaulichen, bei dem die Spitze Hauptpeaks zeigt, die der Masse sowie der Masse des Natriumions und zudem der Masse abzüglich der Masse der IV-DDE-Schutzgruppe entsprechen. Dargestellt ist hier die LCMS-UV-Kurve der gereinigten Probe, die ein sehr reines Produkt bei 21,3 Minuten zeigt, sowie das Massenspektrum, das die Identität dieser gereinigten Trierspitze bestätigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Festphasentechniken anwendet, um nach der Entwicklung funktionalisierte Bis-Peptide herzustellen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Bis-Peptide, Anwendungen bei Protein-Protein-Wechselwirkungen und Katalyse zu erforschen, sobald sie beherrscht wurde. Wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann diese Technik innerhalb von vier bis fünf Tagen zur Synthese eines funktionalisierten Bis-Peptid-Trimeren führen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Kügelchen stets in der Reaktions- und Waschlösung eingetaucht bleiben. Alternativen Methoden wie die parallele Synthese oder Bibliothekssynthese können durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise den Einfluss der Stereochemie oder alternativer Funktionalitäten auf die Proteinbindung oder katalytische Aktivität. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und eines Abzugs.