Die Überwachung der reduktiven und oxidativen Halbreaktionen eines Flavin-abhängige Monooxygenase mit Stopped-Flow Spektrophotometrie

Dieses Verfahren nutzt ein Stopped-Flow-Instrument, um die verschiedenen spektralen Formen von SID A zu detektieren und Geschwindigkeiten zu messen. Die von SID A katalysierte Reaktion kann in die reduktive und oxidative Halbreaktion des FAD unterteilt werden. Das oxidierte Flavin bindet an N-A-D-P-H und reagiert unter Bildung von reduziertem Flavin und NADP plus; die Reaktion mit molekularem Sauerstoff und die Bindung von Ornithin führen zur Bildung von C vier.

Ein Hydroxyflavin nach der Hydroxylierung von Ornithin dehydratisiert das Hydroxyflavin zum gebildeten oxidierten Enzym. NA DP plus bleibt während des gesamten katalytischen Zyklus gebunden und ist das letzte Substrat, das freigesetzt wird. Das Durchfluss-Stopp-Gerät ermöglicht die schnelle Vermischung kleiner Reaktionsvolumina und deren Aufzeichnung.

Die spektralen Änderungen über die Zeit, die mit einem schnellen Durchflussspektrophotometer gemessen werden, ermöglichen es, die Bildungs- und Zerfallsraten von transienten Zwischenstufen in enzymkatalysierten Reaktionen zu bestimmen. Zwei Mitglieder meines Labors, Rita Robinson und Enviro Romero, werden diese Experimente unter Verwendung des Aromastoff-Monooxygenase-Systems als Modell demonstrieren. Geben Sie 250 Milliliter 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer in einen 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab.

Verschließen Sie den Kolben mit einem Gummistopfen, stellen Sie ihn auf ein Rührgerät und verbinden Sie das kurze Rohr des Kolbens mit einer Schlauchleitung. Entgasen Sie den Puffer eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Vakuum unter Rühren, anschließend spülen Sie ihn mit Argon. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal.

Spülen Sie das Kolben schließlich 10 Sekunden lang mit Argon. Trennen Sie den Kolben vom Vakuumverteiler und stellen Sie ihn in die Handschuhbox. Rühren Sie weiterhin kräftig mit offenem Kolben.

Füllen Sie die Reservoir-Spritzen mit 18,13 Einheiten pro Milliliter Glucose-Oxidase und 100 Millimolar Glucose-Lösungen. Stellen Sie nun die Antriebsventile auf die Lade-Position. Füllen Sie die Antriebspritzen.

Danach das F-Ventil in die Antriebsposition drehen. Mit der Pro-Data-Steuerungssoftware den Stopp-Spritze leeren und anschließend den Puffer mittels manueller Erhöhung des entsprechenden Antriebskolbens aus der F-Antriebsspritze durch den Durchflusskreislauf drücken. Danach mit den anderen drei Antriebsspritzen fortfahren und eine Stunde lang äquilibrieren.

Füllen Sie nun die Reservoir-Spritzen erneut auf und wiederholen Sie das Spülen des gestoppten Flusssystems. Um einen mit Sauerstoff gesättigten Puffer herzustellen, sprühen Sie die Lösung eine Stunde lang unter Rühren mit 100 % Sauerstoff durch.

Entfernen Sie dann die kurze Nadel aus dem Fläschchen und warten Sie 10 Sekunden. Danach entfernen Sie die lange Nadel und stellen das verschlossene Fläschchen in die Handschuhbox. Für die N-A-D-P-H-Lösung.

Stellen Sie ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen, das einen Milligramm N-A-D-P-H enthält, in die Handschuhbox. Lösen Sie in 300 Mikrolitern anaerobem, 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer. pH 7,5.

Entfernen Sie 30 Mikroliter, um die NADPH-Konzentration zu bestimmen. Um nun den Sauerstoff aus dem Enzymstamm zu entfernen, geben Sie die Lösung in ein 25-Milliliter-Gefäß mit einem Rührfisch, einem Deckel mit Gummistopfen und einer Aluminiumkappe. Stellen Sie das Gefäß auf Eis.

Verbinden Sie sich mit einer Schlenk-Leitung und entgasen Sie 20 Minuten lang unter Vakuum, gefolgt von einer Spülung mit Argon. Schlussendlich spülen Sie das Gefäß 10 Sekunden lang mit Argon und trennen es von der Vakuum-Ventilplatte. Stellen Sie das Gefäß im Handschuhkasten auf Eis.

Wählen Sie im Fenster des Bedienfelds der Pro-Daten-Steuerungssoftware die Photodiodenmatrix, externe Auslösung und logarithmische Skalierung aus. Starten Sie außerdem die Pro-Daten-Anzeigesoftware und definieren Sie das Verzeichnis zur Speicherung der Datendateien.

Ersetzen Sie nun die Lösung in den Reservoir-Spritzen C und F durch anaerobes 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5). Schalten Sie die Ventile C und F in die Antriebsposition. Klicken Sie im Pro Data-Steuerungssoftware auf „Stop-Spritze leeren“.

Drücken Sie dann den Puffer mithilfe der entsprechenden Antriebskolben manuell aus beiden Antriebsspritzen durch den Durchflusskreislauf. Wiederholen Sie die Spülung mit den Reservoirspritzen C und F noch dreimal. Um eine vollständige Entfernung der Glucose-Oxidase aus dem Durchflusskreislauf sicherzustellen, klicken Sie im Pro-Daten-Steuerungssoftware auf „Baseline“.

Ersetzen Sie die Lösung der Reservoirspritze F durch die Enzymlösung. Drehen Sie das Ventil F in die Antriebsposition. Klicken Sie im Pro-Data-Steuerungssoftware auf „Stoppspritze entleeren“.

Drücken Sie die Enzymlösung aus der Antriebsspritze F durch den Flusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebskolben manuell anheben. Kehren Sie zur Pro-Daten-Steuerungssoftware zurück und stellen Sie die Erfassungszeit auf 60 Sekunden ein. Stellen Sie sicher, dass beide Antriebsspritzen mit ihren jeweiligen Lösungen gefüllt sind und dass die Antriebskolben mit den Kolben der Antriebsspritzen in Kontakt stehen.

Schalten Sie beide Ventile in die Antriebsposition und klicken Sie in der Pro-Daten-Steuerungssoftware auf „Erfassen“, um den Antrieb durchzuführen. Erfassen Sie die spektralen Daten der oxidierten Form des Enzyms im Dreifachansatz unter Verwendung des bei den Antrieben erhaltenen Wertes von A 4 52 Nanometer. Bestimmen Sie die Enzymkonzentration vor dem Mischen und bereiten Sie vier Milliliter N-A-D-P-H-Lösung vor.

1,5-fach konzentrierter Füllreservoir-Spritze C mit der N-A-D-P-H-Lösung und Entleeren und erneutes Befüllen der Stop-Spritze dreimal, wie zuvor gezeigt. Nun Aufnahme der Spektren während der Reduktion des Enzyms; Spülen des Inhalts aus dem Durchflusskreislauf mit anaerobem 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Klicken Sie nun im Pro-Daten-Steuerungssoftware auf „Baseline“.

Anschließend 200 µL Enzym-Stammlösung mit 1000 µL anaerobem, 100 mM Kaliumphosphatpuffer mischen, pH 7,5. Die Lösung der Reservoirspritze A durch die Enzymlösung ersetzen.

Schalten Sie das A-Ventil in der Pro-Data-Steuerungssoftware in die Antriebsposition. Klicken Sie auf „Spritze stoppen leer“. Drücken Sie die Enzymlösung aus der Antriebsspritze A manuell durch die Durchflussleitung, indem Sie den entsprechenden Antriebskolben anheben.

Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 0,5 Sekunden und die Erfassungszeit auf 60 Sekunden ein. Überprüfen Sie, ob alle Treiberspritzen mit den entsprechenden Lösungen gefüllt sind und die Treibervorrichtungen mit den Kolben der Treiberspritzen in Kontakt stehen. Schalten Sie dann alle Treiberventile in die Förderposition und klicken Sie in der Pro-Data-Steuerungssoftware auf „Erfassen“.

Erhalten Sie spektrale Daten der oxidierten Form des Enzyms im Dreifachansatz. Ersetzen Sie anschließend die Lösung der Reservoirspritze B durch eine N-A-D-P-H-Lösung, die 1,5-fach stärker konzentriert ist als die Enzymlösung in der Spritze A. Schalten Sie das Ventil B in die Antriebsposition und leeren sowie füllen Sie die Stoppspritze dreimal, wie zuvor im Steuerungsfenster gezeigt.

Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 0,5 Sekunden ein. Führen Sie nach 20 Sekunden eine Akquisition durch und ersetzen Sie die Lösung der Reservoirspritze mit dem oxygenierten Puffer. Schalten Sie das C-Ventil in die Antriebsposition.

Spülen Sie dreimal in der Pro-Datensteuerungssoftware. Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 15 Sekunden und die Erfassungszeit auf 900 Sekunden ein. Setzen Sie die Spektrenaufnahme während der Re-Oxidation des vollständig reduzierten Enzyms im Stopped-Flow-Gerät fort.

Die anaerobe Reduktion von SID A mit NADPH kann durch Messung der Änderungen im Redoxzustand des Flavins unter Verwendung der Absorption bei 452 nm überwacht werden. Spektrale Veränderungen werden über die Zeit von oxidiertem SID A bis zum Endspektrum vollständig reduzierten SID A aufgezeichnet. Die Geschwindigkeit dieses enzymatischen Schritts kann durch Anpassung der Daten an die geeignete Gleichung bestimmt werden. Die Oxidationsgeschwindigkeit und die Reaktionszwischenprodukte können ebenfalls mithilfe des Doppel-Mischmodus des Stopped-Flow in dieser Reaktion mit AF Sid A ermittelt werden. Das C4a-Hydroxyflavin-Zwischenprodukt wird eindeutig mit einem λmax von 380 Nanometern nachgewiesen, während das oxidierte Enzym ein λmax von 450 Nanometern aufweist.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in vier bis sechs Stunden abgeschlossen werden. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass die Lösungen anaerob sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sowohl das relative als auch das ulzerative Ion von FLA unabhängig weiter stromabwärts in Experimenten wie der schnellen Chemie untersucht.

Quentin kann dazu beitragen, die traurige Natur der Zwischenprodukte aufzuklären.