Eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Rekonstitution eines ABC-Transporter in Nanodisc Lipid Particles

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen A, b, C-Transporter in lösliche Membran-Nanoscheiben-Partikel zu integrieren. In diesem Fall handelt es sich um den Maltosetransporter malf GK zwei. Dies wird erreicht, indem zunächst das Membran-Scaffold-Protein MSP mit dem Transporter und der korrekten Menge an Lipiden in detergenzhaltigen Mizellen gemischt wird.

Der zweite Schritt besteht darin, Polystyrolkügelchen hinzuzufügen und die Mischung über Nacht vorsichtig zu schütteln; das Detergens wird dabei schrittweise auf die Kügelchen adsorbiert, wodurch die Bildung der Nanoscheibenpartikel ermöglicht wird. Anschließend werden die Kügelchen durch Sedimentation entfernt. Der letzte Schritt ist die Trennung korrekt gebildeter Scheiben von Aggregaten und nicht assemblierten Gerüstproteinen mittels Gelfiltrationschromatographie.

Schließlich wird die Qualität der Scheiben mittels natives Gelelektrophorese oder Lichtstreuungsspektroskopie beurteilt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie Liposomen besteht darin, dass Membranproteine und Scheiben vollständig in wässriger Lösung löslich sind. Außerdem sind die Proteindomänen nun von beiden Seiten zugänglich.

Da nun keine Membrankompartimente mehr benötigt werden, konnte ich mithilfe von Membran-Scaffold-Proteinen unterschiedlicher Länge verschiedene Zustände membranständiger Proteine gezielt einfangen und untersuchen. Am wichtigsten ist, dass diese Methode dabei helfen kann, zentrale Fragen im Bereich der Membranproteomik zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung neuartiger Bindungspartner von a, b, C-Transportern. Tatsächlich reichen die Implikationen dieser Technik noch weiter in therapeutische Anwendungsbereiche, da sie die Entdeckung von Aktivatoren oder Inhibitoren membranständiger Proteine und Rezeptoren unterstützen kann.

Obwohl diese Methode einfach erscheint, sollte bei der Wahl des korrekten Protein-Lipid-Verhältnisses Vorsicht walten. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei der Berechnung des richtigen molaren Verhältnisses oder bei der Durchführung der geeigneten Kontrollen, die die Qualität der Präparation sicherstellen. Daher ist eine visuelle Demonstration dieser Methode sehr hilfreich, damit ein neuer Studierender die verschiedenen Schritte und möglichen Schwierigkeiten erlernen kann.

Um hexahistidinmarkiertes MSP in dem E. coli-Stamm BL21 DE3 aus dem Plasmid pMSSP1D1 zu exprimieren, wird die Proteinsynthese induziert, wenn die gemessene optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 beträgt, für drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 5.000 ×g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius gesammelt. Der Pellet wird in TSG10-Puffer, der 100 Mikromolar PMSF enthält, resuspendiert. Die Zellen werden dreimal mit einer French-Presse bei 8.000 psi lysiert. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugation bei 5.000 ×g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius entfernt. Anschließend wird der lösliche Anteil, der das MSP enthält, durch Ultrazentrifugation bei 125.000 ×g für 45 Minuten isoliert.

Reinigen Sie das MSP mittels Nickelaufschluss-Chromatographie unter Verwendung von etwa 1,5 Milliliter Nickel-Seros-Hochleistungsmedium in TSG 10-Puffer. Waschen Sie die Verunreinigungen mit TSG 10-Puffer, der 50 Millimolar ILE enthält, ab. Eluieren Sie das MSP mit TSG 10-Puffer, der 600 Millimolar Imidazol enthält, nach dem Dialysieren.

Das gereinigte Protein in TSG 10-Puffer MSP kann bei minus 70 Grad Celsius und einer Protein-Konzentration von etwa 10 bis 15 Milligramm pro Milliliter gelagert werden. Der MALF GK zwei Komplex, der am C-Terminus von MAL K mit einem His-Tag versehen ist, wird von einem Plasmid exprimiert. PED 22 FG K, in dem E. coli-Stamm BL 21 DE drei kultiviert, induziert die Proteinproduktion, wenn die gemessene optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 beträgt, durch Zugabe von 0,2 % L-Arabinose für drei Stunden bei 37 Grad Celsius, gefolgt von Zelllyse und Zentrifugation.

Wie zuvor suspendieren wir das Membran-Pellet in TSG 20-Puffer auf eine Endkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter. Anschließend solubilisieren wir das Material mit 1 % Gewicht pro Volumen GDM für drei Stunden bei vier Grad Celsius unter sanftem Schütteln. Entfernen Sie das unlösliche Material durch Ultrazentrifugation, wie bei der Reinigung von MAL FTK zwei beschrieben.

Anschließend sammeln Sie den Überstand, der den solubilisierten MalFTK2-Komplex enthält, und reinigen erneut mittels Nickel-Chelat-Chromatographie. Reinigen Sie den Komplex weiter durch Gelfiltrationschromatographie in TSGD-Puffer an einer SUEx 200, HR 10/300-Säule bei einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Zur Herstellung von Phospholipiden wird ein Gesamtlipidextrakt aus E. coli, der in Chloroform gelöst ist, in 1000 Mikroliter-Aliquots in Schraubkappen-Mikrofugegefäßen aufgeteilt, das Lösungsmittel unter einem sanften Stickstoffstrom verdampft und anschließend über Nacht im Vakuum getrocknet.

Trocknen Sie anschließend ab, lösen Sie den Lipidfilm in TS-Puffer mit einer endgültigen Konzentration von fünf NMO auf und wirbeln Sie kräftig, dann führen Sie fünfmal eine Impulsbeschallung für jeweils etwa fünf Sekunden durch. Die gelösten Lipide erscheinen leicht trüb, da sie im Allgemeinen in wässrigem TS-Puffer schlecht löslich sind, sollten aber in Suspension bleiben. Geben Sie DDM bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu. An diesem Punkt wird die Lösung klar; geben Sie die Lipidmischung in ein Wasserbad und führen Sie fünfmal eine Impulsbeschallung für jeweils etwa fünf Sekunden durch.

Das Lipidgemisch kann maximal eine Woche bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für die Vorbereitung der Bio-Beads geben Sie etwa 10 bis 15 Milliliter Bio-Beads in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Kügelchen zunächst mit 50 Milliliter 100 % Methanol.

Lassen Sie die Kügelchen durch Schwerkraft absetzen und gießen Sie die Lösung vorsichtig ab. Wiederholen Sie den Vorgang einmal mit Methanol und dann jeweils zweimal mit 95 % Ethanol, milliQ-Wasser und abschließend mit TS-Puffer. Beginnen Sie die nano diskrete Konstitution, indem Sie MSP im TSGD-Puffer auf eine Endkonzentration von etwa sieben Milligramm pro Milliliter oder 0,3 Millimolar verdünnen.

Um ein erfolgreiches Experiment sicherzustellen, ist es wichtig, die richtigen Verhältnisse von Lipiden und Proteinen zu wählen, die miteinander gemischt werden sollen. Mischen Sie etwa zwei M des gereinigten MalfGK2-Komplexes im Protein-zu-MSP-zu-Lipid-Verhältnis von 1:3:60 in TSGD-Puffer für ein Endvolumen von 300 Mikrolitern. Hier wird zusätzlich eine Probe mit überschüssigem Lipid im Verhältnis von 1:3:400 als Negativkontrolle hergestellt. Geben Sie 50 Mikroliter Bio-Beads-Suspension in das Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung über Nacht auf einem Schütteltisch bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag sedimentieren Sie die Beads durch Schwerkraft. Sobald sich die Beads gesetzt haben, pipettieren Sie die Lösung durch eine schmale Spitze, um möglichst viele Bio-Beads zu vermeiden.

Entfernen Sie große Präzipitate durch Ultrazentrifugation bei 100.000 ×g für 20 Minuten. Reinigen Sie die Scheiben anschließend mittels Gelfiltrationschromatographie wie zuvor in TSG 10-Puffer. Danach injizieren Sie ein Eloqua auf dieselbe Gelfiltrationssäule, um die Stabilität der Präparation zu testen.

Anschließend werden die Fraktionen, die die Scheiben enthalten, vereinigt. Die Qualität der Präparation wird mittels natives Gelelektrophorese beurteilt. Analysieren Sie eine Mikromolar-Lösung der Nanoscheiben, um die Qualität der Rekonstitution zu bewerten.

Beurteilen Sie außerdem die Bindung von mal E an den in Nanoscheiben rekonstituierten mal ftk-Zwei-Komplex. Nach der Elektrophorese das Gel zehn Minuten lang mit Kumasisierblau färben und anschließend etwa eine Stunde lang entfärben. Um eine dynamische Lichtstreuung (DLS) durchzuführen, reinigen Sie zunächst die Nanoscheiben mittels Gelfiltrationschromatographie wie zuvor beschrieben, unter Verwendung einer SUEx 200 HR 10/300-Säule bei einer Flussrate von 0,1 Milliliter pro Minute.

Vereinigen Sie die Fraktionen, die Nano-Scheiben enthalten, und konzentrieren Sie diese mithilfe eines AmCon-Zentrifugalfilters auf etwa 10 Milligramm pro Milliliter. Anschließend filtrieren Sie die Probe zweimal. Führen Sie die Analyse mittels DLS unter Verwendung eines Dynapro Nano Star-Geräts in einer Quarzkapilläre mit einem inneren Volumen von einem Mikroliter durch.

Unter Verwendung der dynamischen Software zur Schätzung des Durchmessers und des Molekulargewichts der Partikel bestimmen Sie die A-TPA-Aktivität von Mal-FTK in zwei rekonstituierten Nanoscheiben mittels eines chromometrischen Assays. Mischen Sie zunächst eine Mikromolar-Lösung der gereinigten Scheiben mit einer Millimolar-Lösung von A-TP unter Zugabe steigender Mengen von Mal-e. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Danach die Freisetzung anorganischen Phosphats bei 660 Nanometern messen. Die freigesetzte Phosphatmenge mit einer Standardkurve vergleichen, die mit einer Phosphor-Standardlösung erstellt wurde. Die Nanoscheiben werden mittels Gelfiltrationschromatographie gereinigt.

Das Chromatogramm zeigt, dass der Großteil der rekonstituierten Scheiben als einzelner Peak eluiert, während Scheiben, die mit überschüssigen Lipiden hergestellt wurden, im Auswaschvolumen und als Serie breiter Peaks eluieren. Die Qualität der Scheibenpräparation wird weiterhin durch native Gelelektrophorese analysiert: Scheiben, die mit einer begrenzten Menge an Lipiden rekonstituiert wurden, wandern im nativen Gel als scharfes Band, während jene, die in Gegenwart eines Überschusses an Lipiden rekonstituiert wurden, als Schmierband wandern. Die Analyse mittels DLS zeigt, dass die Scheibenpopulation homogen ist und einen durchschnittlichen Radius von 5,0 Nanometern aufweist. Basierend auf der DLS-Approximation haben die rekonstituierten Scheiben ein scheinbares Molekulargewicht von 215 Kilodalton. Proben, die in Gegenwart von überschüssigen Lipiden rekonstituiert wurden, weisen stark streuende Radien um 100 Nanometer auf, was typisch für nicht homogene Proben ist.

Die Aktivität des MAL FTK zwei-Komplexes wird durch Messung der TP-Hydrolysegeschwindigkeit und der Affinität zu Interaktionspartnern wie dem Maltose-bindenden Protein MAL E bewertet, das mit hoher Affinität an den MAL FTK zwei-Transporter bindet, wie mittels nicht-denaturierender Gelelektrophorese gezeigt werden kann. Es ist möglich, einen Komplex zwischen MAL E und MAL FTK zwei nachzuweisen; die Stimulation der MAL KA TPA-Aktivität durch MAL E wird hier in Abhängigkeit von der MAL E-Konzentration dargestellt.

Die Herstellung der Nanoscheibe ist vergleichsweise einfach, doch bereits geringe Abweichungen von den optimalen Bedingungen können zu irreversibler Proteinaggregation führen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in weniger als zwei Tagen durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Bedeutung der Wahl eines geeigneten Protein-Lipid-Verhältnisses zu berücksichtigen, da ein Überschuss an Lipiden zur Bildung großer, polydisperser, liposomähnlicher Partikel führt. Daher ist es entscheidend, die Qualität des rekonstituierten Materials mithilfe anderer Methoden als der Gelfiltration zu analysieren, beispielsweise durch Lichtstreuungsspektroskopie, analytische Ultrazentrifugation oder einfacher durch native Gelelektrophorese.

Denken Sie daran, dass sowohl die Art des Phospholipids, das die Scheibe bildet, als auch das Membran-Grundgerüst-Protein die Effizienz der Rekonstitution beeinflussen können. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie lösliche und homogene Nanoscheiben mit Ihrem gewünschten Membranprotein hergestellt werden können. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.