Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen bereits optimierten Eliza-Assay für das Zytokin TNF Alpha auf die Xap-Plattform umzustellen und dabei alternative Antikörperpaare zu evaluieren. Dies wird erreicht, indem der Captur-Antikörper aus dem ELIZA-Kit zusammen mit drei weiteren in Betracht kommenden Captur-Antikörpern an vier verschiedene Mikrosphären- oder Partikelsets gekoppelt wird, die gemeinsam gemischt werden. Diese vier Sets ermöglichen es, alle vier Kandidaten gleichzeitig mit vier separaten Detektionsantikörpern zu testen, um das beste Antikörperpaar zu identifizieren.

Als Nächstes werden zwei Xap-Assays mit den beiden optimalsten Antikörperpaaren aufgebaut. Die Leistung der Assays wird anschließend hinsichtlich Signalstärke, dynamischem Bereich und Empfindlichkeit mit der des ursprünglichen EISA-Assays verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass ähnliche Antikörper unter gleichen Bedingungen sehr unterschiedlich abschneiden können und dass mehrere Antikörper gleichzeitig mittels des Luminex-Xap-Assays getestet werden können, wodurch sich eine höhere Empfindlichkeit und ein größerer dynamischer Bereich im Vergleich zum EISA-Assay ergeben.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie EIS A besteht darin, dass xap-basierte Immunoassays dem Forscher ermöglichen, mehrere Zielstrukturen zu testen oder, wie in diesem Fall, mehrere Antikörper gleichzeitig zu untersuchen, um den besten Antikörper nachzuweisen. Das Verfahren wird von Erica Lopez, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin bei Luminex Corporation, durchgeführt.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Auswahl und Vorbereitung von vier Erfassungsantikörpern und vier Nachweisantikörpern, die spezifisch für humanes TNF-alpha sind, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Bereiten Sie außerdem einen Bestätigungsantikörper vor, der spezifisch für die Wirtsart der Erfassungsantikörper ist. Bringen Sie die Reagenzien aus dem Antikörper-Kupplungs-Kit auf Raumtemperatur.

Etikettieren Sie vier Reaktionsgefäße mit den für die Kopplungsreaktion ausgewählten Bead-Regionsnummern. Überführen Sie den Inhalt der vier Vials mit Mag-Plex-Mikrokugeln in die vier beschrifteten Reaktionsgefäße. Waschen Sie jeden Bead-Satz zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern Aktivierungspuffer und aktivieren Sie jeden Bead-Satz mit den Sulf-NHS- und EDC-Lösungen gemäß der Anleitung im Antikörper-Kopplungs-Kit.

Bedienungsanleitung: Nach einer 20-minütigen Inkubation auf einem Rotator den vorherigen Waschschritt insgesamt dreimal mit den nun aktivierten Perlen wiederholen, jeweils mit 500 µL Aktivierungspuffer. Für jede Wäsche vier separate Lösungen à 500 µL herstellen, wobei jede 7,5 µg Capture-Antikörper im Inaktivierungspuffer enthält.

Fügen Sie diese vier Lösungen mit Fangantikörpern jeweils den entsprechenden Reaktionsgefäßen hinzu. Vortexen Sie jedes Gefäß unmittelbar danach und inkubieren Sie zwei Stunden auf einem Rotator. Wiederholen Sie den Waschschritt mit den nun gekoppelten Perlen insgesamt dreimal mit jeweils 500 µL des im Antikörperkoppelkit enthaltenen Waschpuffers.

Nach dem letzten Waschschritt 500 µL Waschpuffer zu jedem Reaktionsröhrchen hinzufügen, um eine endgültige Stammlösungskonzentration von 5 Millionen Antikörper-gebundenen Perlen pro Milliliter zu erreichen; anschließend die Reaktionsröhrchen vortexen und danach sonifizieren, um die Perlen zu dispergieren. Die Anzahl der nach der Kopplungsreaktion gewonnenen Perlen mit einem Zellzähler oder Hämocytometer bestimmen. Die Ausbeute aus der Kopplungsreaktion liegt typischerweise über 90 %. Bestätigen Sie den erfolgreichen Abschluss der Kopplungsreaktion, indem Sie Testlösungen der gekoppelten Perlen-Stammlösungen für jeden Satz mit einer Endkonzentration von 100 Perlen pro µL im Assaypuffer herstellen und eine Verdünnung des mit FICO-erything markierten Antispezies-Antikörpers vorbereiten.

Bestätigungsserum für IgG bei vier Mikrogramm pro Milliliter in Assaypuffer; aliquotieren Sie jeweils 50 Mikroliter jeder Testlösung in vier Vertiefungen einer runden 96-Loch-Platte, insgesamt 16 Vertiefungen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter Assaypuffer in acht der Vertiefungen zur Hintergrundmessung und 50 Mikroliter des verdünnten Bestätigungsserums in die verbleibenden acht Vertiefungen. Mischen Sie die Ansätze vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einem Mehrkanalpipettiergerät.

Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenrührer. Stellen Sie die Platte anschließend für eine bis zwei Minuten auf einen magnetischen Plattenabscheider, um die Perlen aus der Lösung zu ziehen. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit, indem Sie die Platte kräftig über einem Abfallbehälter auf dem Abscheider umdrehen.

Waschen Sie jede Vertiefung zweimal, indem Sie 100 Mikroliter Assaypuffer hinzufügen und das SANE auf ähnliche Weise von der Platte entfernen. Suspendieren Sie die Beads mithilfe des magnetischen Plattenabscheiders in 100 Mikroliter Assaypuffer erneut, indem Sie sie fünfmal vorsichtig mit einem Mehrkanalpipettiergerät auf- und abpipettieren. Analysieren Sie an einem Luminex-xap-Instrument, beispielsweise dem Magix-Instrument.

Die Intensität des fluoreszierenden Signals dieser Reaktion ist direkt proportional zur Menge des Proteins auf der Oberfläche der Kügelchen und ermöglicht so eine schnelle Beurteilung der relativen Menge des an die Kügelchen gekoppelten Proteins. Um das wirksamste Antikörperpaar im xap-Assay zu bestimmen, bereiten Sie eine Anfangsmischung aller vier Kügelchensorten vor, indem Sie jeweils 10 µL zu 0,96 mL Assaypuffer hinzufügen. Bereiten Sie die Detektionsantikörperlösungen vor, indem Sie jeden Antikörper auf eine Konzentration von einem µg pro mL in Assaypuffer verdünnen.

Außerdem ein Assaypuffer. Bereiten Sie den TNF-alpha-Proteinstandard des r- und d-Systems bei 2000 Pikogramm pro Milliliter vor und verdünnen Sie das Streptavidin-R-Phycoerythrin auf acht Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie 50 Mikroliter der Antikörper-gekoppelten Bead-Mischung in jede der 16 Vertiefungen einer CoStar-Rundboden-96-Loch-Platte für den Screening-Assay.

Anschießend 50 µL Assaypuffer in acht der 16 Vertiefungen hinzufügen, um die Grundaktivität zu bestimmen. Danach 50 µL der TNF-alpha-Standardlösung in die anderen acht Vertiefungen pipettieren, um die Reaktion zu messen. Eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schutz vor Licht und mit Schütteln auf einem Plattenschüttler inkubieren.

Danach 50 µL von jeweils einem der vier Detektionsantikörper in vier Vertiefungen geben, von denen zwei Hintergrundvertiefungen und zwei Reaktionsvertiefungen sind. 30 Minuten unter den gleichen Bedingungen inkubieren, nachdem 50 µL des SAPE-Reagenz zu allen Vertiefungen hinzugefügt wurden. Anschließend erneut 15 Minuten unter den gleichen Bedingungen inkubieren.

Stellen Sie die Platte eine Minute lang auf einen magnetischen Plattenabscheider. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit, indem Sie die Platte kräftig über einem Abfallbehälter auf dem Abscheider umdrehen. Geben Sie 100 Mikroliter Assaypuffer in jede der 16 Vertiefungen.

Entfernen Sie anschließend die Flüssigkeit von den Perlen mittels magnetischer Trennung. Geben Sie danach 100 Mikroliter Assaypuffer in jede der 16 Vertiefungen. Lesen Sie die Platte mit dem Luminex mag picks-Gerät, wobei Sie die Bedienungsanleitung für den korrekten Betrieb heranziehen.

Wählen Sie ein Antikörpapaar aus, das die gewünschte Signalstärke aufweist. Nach der Auswahl des besten Erfassungsantikörpers verdünnen Sie 100 Mikroliter des mit Antikörpern beladenen Bead-Stamms auf 10 Milliliter mit Assay-Puffer. Geben Sie 50 Mikroliter der verdünnten Beads in 78 Vertiefungen zweier CoStar Rundboden-96-Well-Platten.

Jede Platte wird verwendet, um die Leistung eines anderen Detektionsantikörpers zu bewerten. Bereiten Sie anschließend eine 12-Punkte-Standardkurve vor, beginnend bei 8.000 Pikogramm pro Milliliter und endend bei vier Pikogramm pro Milliliter. Mit den r- und d-Systemen.

Fügen Sie sechs 50 µL-Wiederholungen jeder Verdünnung des TNF-Alpha-Standards sowie sechs Vertiefungen mit jeweils 50 µL Assaypuffer als Hintergrundkontrolle zu jeder Platte hinzu, insgesamt 78 Vertiefungen pro Platte. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Lichtschutz mit Schütteln auf einem Plattenschüttler. Geben Sie anschließend 50 µL des ersten Detektionsantikörpers zu allen 78 Vertiefungen der ersten Platte hinzu.

Wiederholen Sie dies für den zweiten Detektionsantikörper auf der zweiten Platte. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten unter denselben Bedingungen. Geben Sie dann 50 µL des SAPE-Reagenz in alle Vertiefungen jeder Platte.

Nachdem die beiden Platten 15 Minuten lang geschützt vor Licht geschüttelt wurden, stellen Sie die Platten eine Minute lang auf magnetische Plattenabscheider. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie die Platte über einem Abfallbehälter kräftig umdrehen, während sie sich auf dem Abscheider befindet. Danach pipettieren Sie 100 Mikroliter Assaypuffer in jede der 78 Vertiefungen der Platten, bevor die Flüssigkeit von den magnetischen Perlen wie zuvor entfernt wird.

Nach Zugabe von hundert Mikrolitern Assaypuffer zu den Kügelchen in jedem der 78 Wells auf den Platten analysieren Sie die Platten mit dem Mag-Picks-Gerät, wobei Sie sich zur korrekten Bedienung auf die Bedienungsanleitung beziehen. Befolgen Sie die mit dem R and D Systems Human TNF Alpha TNFSF1A DUO Set ELISA Kit beigefügten Anweisungen. Messen Sie die Reaktion, die durch den mit dem R and D Kit bereitgestellten Standard erzeugt wird.

Wiederholen Sie den ELISA-Assay dreimal, wobei Sie die Capture- und Detektionsantikörper des r- und d-Systems durch die Antikörper der anderen Hersteller ersetzen. Der Einfachheit halber sollten die Antikörper nach Hersteller gepaart und jedes Paar unabhängig gemäß dem EISA-Format mit jedem der drei TNF-alpha-Proteinstandards bewertet werden. Die Luminex-Xap-Assays wurden als Multiplex durchgeführt, um alle vier Capture-Antikörper gleichzeitig als Gemisch zu bewerten, indem vier Sätze von TNF-alpha-Antikörpern mit Mag-PLX-Mikrokügelchen gekoppelt wurden; die Capture-Antikörper wurden anschließend einzeln mit jedem der vier biotinylierten Detektionsantikörper getestet, sodass die Wechselwirkung eines Detektionsantikörpers mit jedem der vier Capture-Antikörper simultan bestimmt werden konnte.

Die Ergebnisse zeigten, dass das Antikörperein aus dem r- und d-Systems-DUO-Set die beste Leistung erzielte und eine resultierende Reaktion von 6.183 medianen Fluoreszenzintensitätseinheiten oder MFI-Einheiten aufwies. Es wurde außerdem beobachtet, dass die Detektionsantikörper von Millipore und ABAM eine akzeptable Reaktion im XAP-Assay zeigten, wenn sie mit dem Capturing-Antikörper von RD-Systems kombiniert wurden. Dagegen führten die Capturing-Antikörper von Millipore, ACAM und Novus im XAP-Assay zu weniger befriedigenden Ergebnissen. Der Protokollansatz des r- und d-Systems-DUO-Sets wurde verwendet, um die vier Antikörpereinheiten im EISA-Format zu vergleichen.

Das Protokoll von r und d systems wurde mit allen Antikörper-Paaren verwendet, da es typischen, heute weit verbreiteten EIA-Protokollen entspricht und Protokollen mit xap-Technologie analog ist. Die EISA-Tests zeigten, dass das Antikörper-Paar von r und d systems erneut die besten Ergebnisse lieferte. Das Antikörper-Paar von Acam zeigte keine Reaktion, und die Antikörper-Paare von Millipore und Novas zeigten bescheidene Reaktionen, um mögliche Unterschiede in der Antikörper-Reaktivität zu bewerten.

Mit dem Standard wurden alle vier Antikörper-Paare mit drei verschiedenen rekombinanten TNF-alpha-Proteinstandards von drei verschiedenen Anbietern getestet. Die Daten zeigen, dass die rekombinanten TNF-alpha-Proteinstandards der drei Anbieter äquivalente Ergebnisse lieferten. Das TNF-alpha-Protein von r und d Systemen wurde zur Erstellung von Standardkurven mit den ELISA- und den XAP-Assays verwendet.

Während der ELI A-Assay mit dem Antikörpapaar von r und d system durchgeführt wurde, verwendeten die Xap-Assays den immobilisierenden Antikörper von r und d system sowie entweder den detektierenden Antikörper von r und d systems oder von Millipore. Das TNF-alpha-Protein von r und d systems wurde verdünnt, um eine Konzentrationsreihe von 8.000 bis vier Pikogramm pro Milliliter zu erzeugen. Das Antikörpapaar von r und d systems führte im Xap-Assay zum erwarteten Ergebnis mit einer Antwort von über 20.000 MFI, wie dargestellt.

Wenn der Detektionsantikörper von Millipore im Xap-Assay anstelle des Detektionsantikörpers von RD Systems verwendet wurde, betrug die Reaktion etwa 30 % der mit dem Detektionsantikörper von RD Systems erzielten Reaktion. Die grüne Linie in diesem Diagramm stellt die Standardkurve des ELA dar, deren vom Hersteller empfohlener TNF-alpha-Bereich zwischen 16 und 1000 Pikogramm pro Milliliter lag. Aufgrund der Begrenzung des Spektrofotometers war es nicht möglich, den Messbereich des ELISA-Assays zu erweitern.

Weiterhin wird die Dynamik und Empfindlichkeit beider Methoden deutlicher, wenn sie in einer logarithmischen Skala dargestellt werden. Ein klarer Unterschied zwischen der Steigung der EISA-Antwort und den Antworten der xap-Assays ist erkennbar und weist darauf hin, dass die EL iza bei höheren und niedrigeren Konzentrationen eine eingeschränktere Nachweisfähigkeit für TNF-alpha aufweist. Die Nachweisgrenzen oder LOD für die beiden funktionalen TNF-alpha-xap-Assays wurden angenähert, indem die niedrigste TNF-alpha-Konzentration identifiziert wurde, bei der ein beobachtetes Antwortsignal über dem Hintergrund lag und zusätzlich das Dreifache der Standardabweichung (SD) aus sechs Wiederholungen betrug.

Hier ist zu beobachten, dass bei Verwendung des R- und D-Systems-Paares die niedrigste TNF-alpha-Konzentration von 3,91 Pikogramm pro Milliliter eine Antwort von 66 MFI hervorrief, was über der Antwort für den Hintergrund plus dreifacher Standardabweichung liegt, gemäß diesem Kriterium. Wenn der Millipore-Nachweisantikörper zusammen mit dem Erfassungsantikörper des R- und D-Systems verwendet wurde, betrug die Nachweisgrenze weniger als 7,81 Pikogramm pro Milliliter.

In diesem Fall zeigte die zweitniedrigste TNF-alpha-Konzentration eine akzeptable Reaktion mit 17 MFI, was über der Reaktion der niedrigsten TNF-alpha-Konzentration plus dem Dreifachen ihrer Standardabweichung lag. Ebenso wurde die Nachweisgrenze für das r- und d-System-Duo-Set Eliza auf zwischen 63 und 31 Pikogramm pro Milliliter geschätzt. Nach diesem Verfahren können weitere Schritte wie Tests, verschiedene Probenmatrizes oder Antikörperkonzentrationen im Reporter durchgeführt werden, um den Xap-Assay weiter zu optimieren.