Entwicklung einer Bronchiolitis obliterans in einem Mausmodell der orthotopen Lungentransplantation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Modell der obliterierenden Bronchiolitis zu etablieren, das die orthotope Lungentransplantation widerspiegelt. Dies wird erreicht, indem zunächst die Spenderlunge von einer C57BL/10-Maus entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Manschettenadapter für Bronchus, Lungenarterie und Vene zur Anastomose vorzubereiten.

Anschließend wird die präparierte Spenderlunge in eine Empfänger-Maus der C five seven BL six-Linie transplantiert. Im letzten Schritt wird die transplantierte Maus über einen Zeitraum von 21 oder 28 Tagen nach der Transplantation beobachtet. Abschließend dient die histologische Analyse dazu, okklusive Bronchiolitis-Läsionen in der transplantierten Lunge nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieses Modells im Vergleich zum spiegelbildlichen heterotopen Atemwegstransplantationsmodell besteht darin, dass das vorliegende Modell den menschlichen Zustand nachahmt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die oberen Strukturen bei Mäusen sehr empfindlich sind und aufgrund ihrer geringeren Größe – nur ein Zehntel der Masse der Ratte – anfälliger für Verletzungen. Stellen Sie die spendende Maus in eine verschlossene Haltekammer und induzieren Sie die Anästhesie mit 5 % Isofluran. Verwenden Sie anschließend einen intravenösen Katheter mit 20 Gauge, um die Maus zu intubieren, und bringen Sie sie dann auf einen Nagerbeatmungsapparat.

Halten Sie die Anästhesie mit ein bis zwei % Isofluran aufrecht. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Maus durch fehlende Reaktion auf Schwanzzucken und Zehenquetschen vollständig anästhesiert ist, bringen Sie sie in Rückenlage und desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70 % Alkohol. Schneiden Sie nun die Bauchhaut mit einer Schere ab und legen Sie die Bauchmuskulatur frei.

Führen Sie anschließend eine laparale Sternotomie durch, indem Sie zunächst einen medianen Schnitt durch die Bauchwand anlegen und dann quer über das Sternum schneiden. Verlagern Sie die Därme beiseite und lokalisieren Sie die untere Hohlvene, die sich direkt unterhalb der Leber befindet. Injizieren Sie Heparin in einer Dosis von 100 Mikrolitern pro Kilogramm in die V. cava inferior. Ziehen Sie danach das falciforme Ligament der Leber nach unten und durchtrennen Sie das Zwerchfell entlang der ventralen kaumalen Ansatzstelle in Richtung Wirbelsäule.

Schneiden Sie beide Seiten der Brustwand bis zum Hals, um die Brusthöhle freizulegen. Durchtrennen Sie den Rippenkorb beidseitig, wobei Sie die Lunge schützen, und entfernen Sie den Thymus. Schneiden Sie anschließend die intrathorakale V. cava inferior auf Höhe des Zwerchfells durch.

Suchen Sie nun das Herz und entfernen Sie den rechten Atriumanhang. Führen Sie anschließend einen Querschnitt an der Wurzel des Lungenarterienstamms durch und spülen Sie die Lungen über diesen Schnitt mit zwei Millilitern gekühlter Ringer-Laktatlösung und 0,1 Millilitern Heparin aus. Legen Sie die Trachea frei und schneiden Sie sie zusammen mit der Speiseröhre heraus.

Halten Sie die Beatmung nun bei zwei Dritteln der endexspiratorischen Aufblähung an. Entfernen Sie das Herz im Langblock und lagern Sie es auf Eis. Legen Sie einen Verband auf die entnommene Lunge, um sie vor Licht zu schützen.

Schneiden Sie das Lungenband bis zur Lungenvene oder pv ein. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Aorta, um das Hilum zu lokalisieren. Finden Sie die Lungenarterie oder pa, die sich am kranialsten Abschnitt des Hilus sowie am zugehörigen Hauptbronchus befindet.

Lösen Sie die Lungenarterie vorsichtig vom Bronchus. Stellen Sie nun eine Lungenarterienmanschette aus einem 24-Gauge-IV-Katheter her, indem Sie ihn auf eine Länge von 0,5 Millimetern mit einem Überstand von 0,7 Millimetern zuschneiden. Die Oberfläche der Manschette ist AB-geflochten.

Um eine Oberfläche für die Anastomose bereitzustellen, fertigen Sie eine Manschette für den Bronchus aus ähnlichem Material wie der PA-Manschette an, verwenden jedoch einen Katheter der Größe 20, der auf eine Länge von einem Millimeter mit einem Überstand von 0,7 Millimetern zugeschnitten ist. Die Größe der PV-Manschette variiert je nach Gewicht der Spendermaus. Für Mäuse mit einem Gewicht von 24 bis 27 Gramm.

Die Manschettengröße beträgt 22 Gauge mit einer Länge von 0,7 Millimeter und einer Erweiterung von 0,7 Millimeter für Mäuse mit einem Gewicht von 27 bis 32 Gramm. Die Längen sind identisch, jedoch wird eine 20 Gauge-Kanüle verwendet. Nun werden die Manschetten in das distale Ende des Lungenarterien-Lungenvenen-Bronchus eingeführt und jeweils mit einer 9-0-Seidennaht befestigt.

Nachdem alle Manschetten ordnungsgemäß angebracht wurden, wickeln Sie die vorbereitete Spenderlunge in mit Ringer-Laktat getränkte Gaze ein und legen Sie sie bis zur Transplantation auf Eis. Um das empfängertaugliche Mäuschen vorzubereiten, induzieren Sie eine Anästhesie und stellen Sie es auf die mechanische Beatmung, und zwar auf die gleiche Weise wie beim Spender.

Rasieren Sie die linke Brustwand und desinfizieren Sie sie mit 70 % Alkohol. Beginnen Sie mit einem thorakotomen Schnitt im linken dritten Interkostalraum. Verlängern Sie den Schnitt dorsal nahe der Wirbelsäule.

Stellen Sie sicher, dass das Operationsfeld steril abgedeckt ist, und setzen Sie eine Mikrogefässklemme an die linken Lungengefäße und den Bronchus in der Nähe des Herzens an. Die Lungenarterie ist am kranialen Abschnitt sichtbar, die Lungenvene am kaudalen Ende des Hilus und der Bronchus zwischen beiden. Anschließend üben Sie vorsichtige Zugkraft mit einer Hämostaseklemme aus, um eine leichte Spannung auf die Arteria pulmonalis, die Vena pulmonalis und den Bronchus auszuüben.

Lassen Sie die hilären Strukturen abgeklemmt und reseziern Sie vorsichtig die linke Lunge. Isolieren Sie die Arteria pulmonalis, die Vena pulmonalis und den Bronchus und legen Sie dann einen 0-Schnitt nahtlos locker um jede Struktur. Dissezieren Sie die Arteria pulmonalis vollständig aus ihrer adventitiellen Hülle heraus und führen Sie anschließend einen kleinen transversalen Schnitt von etwa einem Viertel des Gefäßumfangs in die vordere Wand ein.

Während der Fortsatz des dorsalen Teils der Arterie erhalten bleibt, entnehmen Sie die Spenderlunge, die in kaltem, mit Ringer-Laktat getränktem Mulltuch eingewickelt ist, und positionieren Sie sie in die Brusthöhle. Anschließend führen Sie die Manschetten in die pulmonale Arterie (pa), die Pulmonalvene (PV) und den Bronchus des Empfängers ein, um eine Anastomose zu schaffen, und ligieren diese mit einer Nano-Naht. Danach entfernen Sie die Empfängerlunge.

Entfernen Sie dann die hilarische Kreuzklemme, wodurch eine Reperfusion und Ventilation ermöglicht wird. Positionieren Sie die transplantierte Lunge wieder in den Empfänger-Thorax und schließen Sie den Thorakotomie-Schnitt. Mit einer 5-0-Naht sollte sich die Maus nun von der Anästhesie erholen. Buprenorphin kann verabreicht werden, um Schmerzen zu lindern, nachdem die Maus das Bewusstsein wiedererlangt hat.

Diese Tabelle zeigt die histologischen Werte für akute Abstoßung und das Vorkommen von obliterierender Bronchiolitis oder OB. Die Bewertung der akuten Abstoßung nach der Transplantation wird als A-Score bezeichnet. Die Allograft-Kombinationen weisen im Vergleich zum ISO-Graft deutlich ausgeprägtere akute oder chronische Abstoßungserscheinungen auf. Zudem war das Vorkommen von obliterierender Bronchiolitis an den Tagen 21 und 28 nach der Transplantation bei den Allograft-Kombinationen signifikant höher als beim ISO-Graft.

Die makroskopischen Befunde und die histopathologischen Ergebnisse 28 Tage nach Lungentransplantation werden hier gezeigt. Diese Bilder zeigen makroskopische Befunde sowie H-und-E-gefärbte ISO-Graft-Lunge und die rechte naive Lunge. Diese Aufnahmen repräsentieren H-und-E- und MASen-Trireme-gefärbte BL-10-Lungenallografts, die in BL-6-Mausempfänger transplantiert wurden und jeweils OB bzw. nicht-OB entwickelten.

Der weiße Pfeil in einem B identifiziert die OB-Läsionen. Dieses Panel zeigt sechs BL-Lungen-Allotransplantate, die in einen BL-10-Maus-Empfänger transplantiert wurden, nachdem die Technik beherrscht wurde. Wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann diese Technik in fast einer halben Stunde abgeschlossen werden.

Der Nutzen dieser Technik liegt darin, dass sie genutzt werden kann, um mechanistische Fragen bezüglich der primären Transplantatdysfunktion, der akuten Abstoßung und der obliterierenden Bronchiolitis nach Lungentransplantation zu beantworten.