Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die räumlichen und zeitlichen zellulären Dynamiken zu identifizieren, die an der Angiogenese beteiligt sind, definiert als das Wachstum neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden. Mit einem einfachen, reproduzierbaren Modell wird zunächst die Angiogenese ausgelöst, indem das Rattenmesenterium kurzzeitig exponiert wird, und mesenteriale Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation gewonnen. Anschließend werden Gewebeschnitte immunmarkiert.

Verwenden Sie beispielsweise einen endothelialen Zellmarker, um das gesamte umgestaltete Gefäßsystem innerhalb eines Gewebes sichtbar zu machen und eine wesentliche zweidimensionale Darstellung wachsender mikrovaskulärer Netzwerke zu erstellen. Dieses Modell ist attraktiv, da es insgesamt innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums einen deutlichen Anstieg mehrerer angiogener Parameter hervorruft. Die Visualisierung der Netzwerke auf Einzelzell-Ebene sowie die Korrelation dieser Parameter mit multizellulärer Markierung haben sich als äußerst nützlich erwiesen, um neuartige Zellphänotypen, die mit Kapillarauswüchsen verbunden sind, zu identifizieren.

Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen bezüglich der zellulären Dynamik im Zusammenhang mit dem Wachstum mikrovaskulärer Netzwerke zu beantworten. Dazu gehören die zeitliche Abfolge und der Ort, an dem bestimmte Zellen während des Kapillar-Auswuchsprozesses vorhanden sind. Die Hauptvorteile dieser Methode liegen in ihrer Einfachheit, dem geringen chirurgischen Aufwand und der hervorragenden angiogenen Antwort innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums.

Außerdem nutzt es das Raphe-Mesenterium, ein Gewebe, das die Beobachtung eines intakten Netzwerks bis auf die Ebene der einzelnen Zelle ermöglicht. Nach unserer Erfahrung ist es sehr einfach zu erlernen und folglich von einem Forscher zum anderen reproduzierbar, was die Durchführung des Verfahrens demonstriert. Heute wird Peter Stapler, ein Doktorand in unserem Labor, die Vorbereitung auf die Operation gemäß dem beigefügten Text durchführen.

Nachdem der Bauchbereich der Ratte rasiert wurde, positionieren Sie die anästhesierte Ratte auf dem Rücken auf einer Heizplatte, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Reinigen Sie den Bauchbereich abwechselnd mit sterilen GREs, die in 70 % Isopropanol, Alkohol und Jod getränkt sind. Führen Sie etwa einen Zoll unterhalb des Brustbeins einen kleinen Längsschnitt entlang der Haut und dann entlang der Linea alba durch. Legen Sie das vorgeschnittene Tuch über den Bauchbereich, sodass die Öffnung mit dem Schnitt übereinstimmt. Üben Sie vorsichtig Druck um den Schnitt herum aus, um den Dünndarm freizulegen. Ziehen Sie mit Wattestäbchen vorsichtig einen Abschnitt des Dünndarms heraus, legen Sie das Mesenterium auf die Kunststoffplatte, die sterile Kochsalzlösung enthält, und lokalisieren Sie das Ileum.

Identifizieren Sie sechs bis acht vascularisierte mesenteriale Fenster, die dünne, durchscheinende Membran zwischen den Arterien- und Venenpaaren, die den Dünndarm versorgen. Notieren Sie die Startzeit der Exposition und stellen Sie einen Timer auf 20 Minuten. Markieren Sie die beiden mittig gelegenen mesenterialen Fenster mit steriler 7-0-Naht im Fettgewebe nahe dem Darm.

Ersetzen Sie die Kochsalzlösung in der Petrischale intermittierend unter Verwendung einer sterilen Fünf-Milliliter-Spritze, um sicherzustellen, dass das Gewebe weiterhin eingetaucht und feucht bleibt. Nach Ablauf der ausgeschalteten Zeitdauer wird das Mesenterium in die Bauchhöhle zurückverlegt. Schließen Sie den Bauchmuskel mit einer Fünf-Null-Monofilnaht in unterbrochener Technik.

Danach die Haut mit vier Einzelknopfnähten aus monofilem Nahtmaterial der Stärke 0 verschließen, den Nahtbereich mit steriler Gaze, die in 70 % Isopropanol getränkt ist, abwechselnd mit Alkohol und Jod abwischen, Augenschmiergel auf beide Augen der Ratte auftragen und das Tier in seinen Käfig zur Erholung zurückbringen. Am gewünschten Tag nach der Stimulation die Ratte gemäß den institutionellen Richtlinien anästhesieren und euthanasieren. Anschließend die Bauchhöhle erneut öffnen und den Bauchbereich mit einer Folie abdecken. Nun vorsichtig den Dünndarm herausziehen und die beiden markierten Fenster mithilfe von Pinzette und Mikroschere lokalisieren.

Schneiden Sie jedes der ausgestülpten mesenterischen Fenster aus, wobei ein Rand aus Fettgewebe mit einbezogen werden sollte. Vermeiden Sie es, Arterien- und Venenpaare innerhalb des fetten Randes der Fenster zu durchtrennen, um eine mögliche Blutansammlung in den Fenstern zu minimieren. Minimieren Sie außerdem das Durchtrennen des Darms, das zu Darminhalt führen könnte.

Die Fenster sofort nach dem Entnehmen in PBS tauchen. Anschließend mit einer Pinzette die Gewebe auf positiv geladenen Objektträgern ausbreiten. Pro Objektträger zwei Gewebe präparieren. Nachdem die Gewebe teilweise getrocknet sind, überschüssiges Fett mit einer Skalpellklinge entfernen.

Fixieren Sie die Proben in Methanol für 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius, indem Sie sie in den Gefrierschrank stellen. Die Objektträger im Vakuum trocknen, um überschüssige Pufferlösung zu entfernen. Umranden Sie außerdem das Gewebe mit einem Wachsstift, um eine unkontrollierte Ausbreitung der Antikörperlösungen außerhalb des Gewebes zu verhindern.

Geben Sie nun etwa 200 Mikroliter der verdünnten Primärantikörperlösung tropfenweise auf, um das gesamte Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur und waschen Sie das Gewebe mit PBS plus 0,1 % Sapin bei drei Pufferwechseln. Fügen Sie anschließend die Strep-Adin-Peroxidase-Sekundärantikörperlösung hinzu und inkubieren Sie nach drei Waschungen eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Proben danach 15 Minuten in Vector Nova Red.

Mit Wasser spülen, um die Objektträger zu montieren. 10-mal in 95 % Ethanol eintauchen, gefolgt von aufeinanderfolgenden Dehydrierungsschritten. Die Objektträger trocknen lassen, sodass die Gewebe mit einer dünnen Schicht bedeckt werden; beeinflussen Sie Menge und Position der Deckgläschen nach dem Vakuumtrocknen und Markieren.

Die Objektträger. Bedecken Sie die Gewebeproben mit verdünnter Primärantikörperlösung. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.

Dreimal mit PBS plus 0,1 % Saponin je 10 Minuten waschen. Anschließend die sekundäre Antikörperlösung hinzufügen und eine Stunde inkubieren. Die Waschschritte in PBS plus 0,1 % Saponin durchführen, die Objektträger in PBS mit Glycerin auflegen und mit Nagellack versiegeln.

Hier beschreiben wir die Modifikation einer üblichen Petrischale für die Verwendung als Operationsplattform. Gelber Modellierknet wurde verwendet, um eine glatte Oberfläche zu schaffen, durch die das Mesenterium durch die vorher ausgeschnittene Öffnung gezogen werden kann. Nochmals, die hier während der Ausschleusungsphase in der Plattform gezeigten mesenterischen Fenster werden definiert als die dünnen, durchscheinenden Membranen zwischen den Arterien- und Venenpaaren, die den Darm versorgen.

Die PCAM-Markierung identifiziert alle Gefäßtypen entlang der Hierarchie von umgestaltenden mikrovaskulären Netzwerken zu bestimmten Zeitpunkten nach der Externalisierung. Diese Bilder können verwendet werden, um angiogenetische Parameter zu bestimmten Zeitpunkten zu quantifizieren. Nach der Stimulation.

Die PCAM-Markierung ermöglicht die Unterscheidung von Arterien gegenüber Venen. Beachten Sie, dass die speisenden Arterien typischerweise kleinere Durchmesser und eine längliche Endothelzellmorphologie im Vergleich zu den zugehörigen Venen aufweisen. Typische Merkmale umgestalteter Netzwerke umfassen den vascularisierten Bereich, Kapillarwachstum und die Gefäßdichte.

Die Quantifizierung dieser verschiedenen angiogenen Parameter beschreibt den zeitlichen Verlauf des Netzwerkwachstums. Die Kapillar-Auswucherung aus bereits bestehenden Gefäßen erreicht zwischen Tag drei und Tag fünf einen Höhepunkt und kehrt bis zum Tag 10 auf das Niveau der unbehandelten Kontrolle zurück. Diesem vorübergehenden Anstieg der Auswucherung folgen in unserem Labor erhöhte Werte für den vascularisierten Bereich und die Gefäßdichte.

Dieses Modellsystem wurde verwendet, um neuartige zelluläre phänotypische Veränderungen zu bestimmten Zeitpunkten während dieses Umbauprozesses zu identifizieren. Die immunfluoreszenzmarkierte PCA-Färbung färbt Endothelzellen rot, während die Markierung von Klasse-drei-Beta-Tubulin Nerven und Parasiten entlang angiogener Gefäße grün anfärbt. Interessanterweise ist die Expression von Klasse-drei-Beta-Tubulin in nicht stimulierten Geweben auf Nerven beschränkt.

Im Gegensatz dazu wird Klasse-drei-Beta-Tubulin während des Höhepunkts der Kapillar-Aussprossung von perivaskulären Zellen exprimiert. Diese Art von Ergebnis unterstreicht die Anwendung dieses einfachen und robusten angiogenen Modells zur Identifizierung neuartiger Zelltypen, die am Angiogeneseprozess beteiligt sind. Ab Tag 10 beginnt das Expressionsmuster von Klasse-drei-Beta-Tubulin sich wieder dem unstimulierten Zustand anzunähern.

Dieses Modell könnte zudem potenziell für Zelllinien-Studien verwendet werden. Die Machbarkeit der Einlagerung von Zellen in umgestaltendes mesenteriales Gewebe wird durch diese Vorläuferuntersuchungen gestützt, bei denen vorgefärbte Knochenmarkzellen oder mesenchymale Stammzellen während des 20-minütigen Expositionszeitraums über mesenteriale Fenster fusioniert wurden. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie unser Ratten-Mesenterium-Innerialisierungsmodell genutzt werden kann, um die zellulären Dynamiken während des Wachstums mikrovaskulärer Netzwerke zu untersuchen.

Diese einfache Technik kann in etwa 45 Minuten bis einer Stunde durchgeführt werden. Denken Sie daran, dass es entscheidend ist, das Mesenterium vorsichtig zu behandeln und nach einem chirurgischen Eingriff das Durchstechen von Gefäßen zu vermeiden. Mithilfe einer Immunfärbung können mehrere Zelltypen entlang von Blutgefäßen identifiziert werden.

Sie können auch lymphatische Gefäße und Nerven markieren. Dies ermöglicht es uns, nicht nur die zellulären phänotypischen Veränderungen, die an der Angiogenese beteiligt sind, zu untersuchen, sondern auch die Koordination zwischen Angiogenese, Neurogenese und lymphatischer Angiogenese.