Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, wiederholte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit bzw. Wasserdurchlässigkeit der Wände von Ular-Mikrogefäßen im Mesentar der Ratte unter kontrollierten experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Dies wird durch die Kanülierung eines ularen Mikrogefäßes erreicht, um die Einstellung des onkotischen und hydrostatischen Drucks im Lumen zu ermöglichen und die chemische Zusammensetzung der üppigen Acht und Suses Acht genau zu steuern. Als nächstes wird das Gefäß verschlossen und rote Blutkörperchen, die in der PERFUSE-Acht suspendiert sind, die als Flussmarker fungieren, können als Indikatoren für den transvaskulären Flüssigkeitsaustausch im Lumen beobachtet werden.

Dann werden die Position und Geschwindigkeit der Marker-Erythrozyten entweder in Richtung der Okklusionsstelle oder weg von der Okklusionsstelle aufgezeichnet. Schließlich wird der Verschluss gelöst und für weitere Messungen wiederholt oder das Gefäß wird rec. Kanüliert und Messungen werden unter veränderten Bedingungen wiederholt.

Letztendlich können gepaarte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit unter Kontroll- und Testbedingungen durchgeführt werden, um die direkteste Untersuchung der Faktoren zu ermöglichen, die Mikrobehälter regulieren. Permeabilität. Ein Vorteil der modifizierten landis-Technik zur Untersuchung der Regulation der Kapillarpermeabilität ist der Perfusionsschritt. Die Mikroperfusion ermöglicht die Messung der Durchlässigkeit der Mikrogefäßwand unter Bedingungen, unter denen die Zusammensetzung der PERFUSE Acht, die Oberfläche für den Austausch und der Druck der Mikrogefäße direkt gesteuert werden.

Diese Methode kann Fragen zu zellulären und molekularen Mechanismen der Permeabilitätsregulation in Mikrogefäßen beantworten, die repräsentativ für intakte Organe sind, und sie kann einen Vergleich mit Ergebnissen aus kultivierten endothelialen Monoschichten ermöglichen, die häufig zur Untersuchung der Details molekularer Mechanismen verwendet werden. Unser Protokoll wird von Joyce Clark, unserer Laborleiterin, demonstriert. Joyce war während ihrer Zeit hier als Laborleiterin für viele der Verbesserungen dieses Protokolls verantwortlich.

Zu Beginn formen Sie mit einem elektronischen Abzieher mehrere Kapillarrohre aus sauberem Boro-Silikatglas zu konischen Hälften mit einer Spitzenlänge von jeweils etwa einem Zentimeter, wobei Sie eine druckluftbetriebene Schleifscheibe und ein in Wasser gebadetes 0,5-Mikron-Schleifpapier sowie einen Mikropipettenhalter verwenden, der in einem Winkel von 30 Grad zur horizontalen Fase eingestellt ist. die Mikropipetten. Nach dem Waschen und Trocknen der Mikropipetten gemäß dem Textprotokoll wählen Sie Mikropipetten mit einer Öffnung von etwa 50 Mikrometern Länge und einem Verhältnis von Fasenlänge zu Breite zwischen 3,1 und 3,5. Sie sollten auch eine scharf zulaufende Spitze haben, die hilft, die zähen Kollagenfasern im Mesenterium zu durchdringen.

Um Fesseln herzustellen, halten Sie eine nicht abgeschrägte gezogene Glaskapillare kurz in die Nähe einer Mikroflamme, um ein stumpfes Ende zu bilden. Wiederholen Sie den Vorgang, um mehrere Rückhaltemittel herzustellen und in einer staubfreien Schachtel aufzubewahren. Machen Sie dann Mikrookkluden, indem Sie ein nicht abgeschrägtes gezogenes Kapillarrohr schräg unter eine Mikroflamme halten und verwenden Sie einen Schlauchadapter oder eine zerbrochene Mikropipette, um das Röhrchen vorsichtig etwa vier Millimeter von der Spitze entfernt in einem Winkel von fast 120 Grad zu biegen.

In Bezug auf den Schaft ist es wichtig, dass die Spitze weder in der Flamme abgedichtet noch gebrochen ist. Nachdem Sie eine Ratte betäubt und das Mesentärgewebe und den Darm gemäß dem Textprotokoll angeordnet haben, positionieren Sie das Tiertablett so auf dem Mikroskoptisch, dass das Mesentar durch die Okulare sichtbar ist. Positionieren Sie eine durch Schwerkraft gespeiste Tropfleitung aus Säugetierringerlösung auf eine kontinuierliche Supersicherung.

Das Mesentar verwendet dann Mullpolster, um den Darm an Ort und Stelle zu halten, Feuchtigkeit zu speichern und überschüssige Ringer von der Oberfläche abzuleiten, den Durchfluss anzupassen und das Abwasser abzusaugen, um eine konstante Schicht von Suse Eight aufrechtzuerhalten, Ziel-Flar-Mikrogefäße zu identifizieren, bei denen es sich um unverzweigte Segmente stromabwärts der konvergenten Strömung und ein oder zwei Äste distal der echten Kapillaren handelt. Finden Sie ein unverzweigtes Gefäß mit lebhaftem Blutfluss und frei von weißen Blutkörperchen, die an der Gefäßwand kleben. Besitzen. Positionieren Sie die Testmikrogefäße in der Mitte des Mikroskopfeldes und bringen Sie den Restrainer in die Nähe der gewählten Kanülierungsstelle.

Um die Mikropipette zu füllen, ziehen Sie die Perfunde acht und waschen Sie die Erythrozyten in eine Spritze, die gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurde, und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Schlauch befinden. Schieben Sie den Schlauch in das große Ende der Mikropipette ein, bis er an den konischen Bereich anliegt. Drücken Sie leicht und schnell auf den Spritzenkolben, um die Mikropipettenspitze zu füllen.

Ein winziger Strahl oder Tropfen erscheint an der Spitze, wenn er voll ist. Drücken Sie beim Herausziehen des Schlauchs vorsichtig auf den Kolben, um den Mikropipettenschaft zu füllen. Entfernen Sie als Nächstes kleine Blasen im Schaft, indem Sie ihn vorsichtig schnippen.

Setzen Sie dann die Mikropipette in einen Pipettenhalter mit einem seitlichen Anschluss ein, der einen kontinuierlichen Flüssigkeitsanschluss an ein Wassermanometer ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass der Halter, der an einem hydraulischen Antrieb und Mikromanipulator befestigt ist, in einem leichten horizontalen Winkel eingestellt ist, damit die Kante des Mikropipettenkegels nicht auf den Darm oder das Tablett trifft. Stellen Sie mit einer Spritze oder einem mit Wasser gefüllten Gummikolben den hydrostatischen Druck ein, der auf die Flüssigkeit in der Mikropipette wirkt, indem Sie die Höhe der Flüssigkeit in der Wassersäule des Manometers auf etwa 40 Zentimeter Wasser über dem Mesenterium ändern.

Bevor Sie die gefüllte Mikropipette unter dem Mikroskop positionieren, drücken Sie den Reiz vorsichtig auf das Gewebe in der Nähe der Mikrogefäße, üben Sie ausreichend Kraft aus, um das Gewebe zu greifen, ziehen Sie den Beutel leicht zurück und dehnen Sie das Gewebe in einer Linie mit den Mikrogefäßen, so dass die Spannungen in den mesenterialen Kollagenfasern mit dem Gefäß ausgerichtet sind. Richten Sie die Mikropipette auf das Gefäß aus und senken Sie es durch die Okulare ab. Platzieren Sie die Spitze knapp stromaufwärts der gewählten Kanülierungsstelle und senken Sie sie so auf das Gewebe ab, dass sie den Fluss innerhalb des Gefäßes teilweise behindert, aber nicht verschließt.

Kanülieren Sie das Gefäß mit dem hydraulischen Antrieb, indem Sie die Pipettenspitze langsam in das Gefäßlumen treiben und darauf achten, dass die Spitze nicht durch die andere Seite des Gefäßes gedrückt wird. Wenn die Mikropipette in das Lumen eintritt, wäscht die Perfund-Acht das Blut schnell aus dem Gefäßlumen und gelangt in den Kreislauf. Senken Sie den Perfusionsdruck, indem Sie das Manometer so einstellen, dass die roten Blutkörperchen im Gefäßlumen sanft oszillieren.

Dadurch wird der Ausgleichsdruck bestimmt, der den hydrostatischen Mikrogefäßdruck (PC) am distalen Ende des Mikrogefäßsegments misst. Halten Sie die Gefäßperfusion über diesem Gleichgewichtsdruck, um einen Mikroverschluss durchzuführen. Platzieren Sie den Blocker über dem perfundierten Gefäß in der Nähe des unteren Randes des Mikroskopfeldes unter Verwendung von Video und Audio.

Notieren Sie verbal die Position der Blockstelle, wie sie im roten I-Stück zu sehen ist. Die Blockstelle ist 57, wobei die Spitze des Blockers direkt über dem Mikrogefäß platziert ist. Verwenden Sie den feinen Z-Regler des Mikromanipulators, um den Blocker vorsichtig abzusenken, bis der Durchfluss im Gefäß verschlossen ist.

Verwenden Sie Audio, um den Manometerdruck zu notieren. Der Druck beträgt 50. Wenden Sie dann eine Okklusion für drei bis 10 Sekunden an und lassen Sie los.

Um die freie Perfusion wiederherzustellen, bewegen Sie die Blockstelle in Schritten von fünf bis 10 Mikrometern das Gefäß hinauf in Richtung Pipettenspitze und führen Sie an jeder Stelle nicht mehr als drei bis fünf Okklusionen durch, um eine Beschädigung der Gefäßwand an der Blockstelle zu vermeiden. Analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Dieser Zeitverlauf misst die Veränderungen der hydraulischen Leitfähigkeit bzw. LP.In eines ratulären Mikrogefäßes, das mit vier Perfundachten erfolgreich kanüliert wurde.

Die Größe von LP bei konstantem Druck wurde verwendet, um Veränderungen in Mikrogefäßen zu messen. Wandpermeabilität bei Perfusion mit 1 %BSA als Kontrolle im Vergleich zu 10 Molaren des Entzündungsmittels Brady Kinin oder bk. Wie hier gezeigt, verursachte BK einen vorübergehenden Anstieg der LP, der innerhalb von 10 bis 15 Minuten auf die Kontrollwerte zurückkehrte.

Nach Wiederherstellung der Ausgangswerte mit 1 %BSA 10 Nanomolar. BK wurde zusammen mit einer mikromolaren pH-Szene, einem Phosphat oder S einem P reperfundiert. Die Ergebnisse zeigen, dass das S und P die Reaktion auf bk signifikant abschwächte. Für einige Versuchspläne ist es wichtig, sowohl den Lösungsreflexionskoeffizienten für ein Makromolekül als auch den lp zu schätzen.

Dies wird am besten durch die Messung des Joint Ventures bei mehreren Drücken an jedem einzelnen Mikrobehälter erreicht. Dieses Experiment schätzte sowohl LP als auch den effektiven onkotischen Druck von 5% Albumin in der PERFUSE acht, wenn kein Albumin im Gewebe um die Mikrogefäße herum vorhanden war. JV über S wurde bei drei verschiedenen Drücken gemessen und aufgetragen. Hier.

Der LP ist die Steigung des Verhältnisses zwischen dem Joint Venture über S und dem Druck, und der Schnittpunkt auf der Druckachse ist die effektive onkotische Druckdifferenz über die Behälterwand. In Kombination mit anderen Techniken wie Immunfluoreszenzmarkierung und konfokaler Mikroskopie oder sogar Transmissionselektronenmikroskopie ermöglicht die Mikroprofusion eine leistungsstarke Analyse des mikrovaskulären Endothels und der Funktion unter Verwendung von Gefäßen bekannter Permeabilität. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie wiederholte Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit oder Wasserdurchlässigkeit von ularen Mikrogefäßen im Ratten-Mesentry unter kontrollierten experimentellen Bedingungen durchführen können.

Man kann diesen Ansatz in derzeit verfügbaren Rattenmodellen anwenden, aber ich bin besonders an der Möglichkeit interessiert, dass er bei neuen gentechnisch veränderten Ratten eingesetzt werden kann, die mit der CRISPR Cas nine-Technologie verfügbar werden, und ich hoffe, dass er auf diese Weise erweitert wird.