Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym
20. Januar 2013
Der kraniale Mesenchym erfährt dramatischen morphogene Bewegungen, die wahrscheinlich stellt eine Antriebskraft für die Elevation der Neuralfalten 1,2. Hier beschreiben wir ein einfaches Ex vivo Explantation Assay, um die zellulären Verhalten der Schädelbasis Mesenchym während Neurulation charakterisieren. Dieser Test hat zahlreiche Anwendungen, darunter gefügig zu sein pharmakologischen Manipulationen und Live-Imaging-Analysen.
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, das Verhalten der cranialen Meen-Chiming-Kultur unter definierten Kulturbedingungen zu überwachen. Der erste Schritt besteht darin, die Uterushörner von einer zeitlich befruchteten Maus zu entnehmen.
8,5 Tage nach der Befruchtung. Nach der Isolierung werden die Embryonen aus der Decidua entfernt und der Dottersack zur Genotypisierung entnommen. Anschließend werden die kranialen mesenchymalen Gewebe mikrodisseziert und auf mit extrazellulärer Matrix beschichteten Zellkulturplatten übertragen.
X-Explanten werden angeheften lassen und bis zu 48 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit definierter pharmakologischer Substanzen kultiviert. Abschließend werden Bilder der Explanten aufgenommen, um Unterschiede in der Zellmigration darzustellen. Diese Methode eignet sich dazu, zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Signalwege und extrazellulären Matrixproteine an dem Verhalten der Cranio-ähnlichen Zellen während der Neuralrohr-Faltung beteiligt sind und dieses steuern.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Mikrodissektion schwer zu erlernen sind und Geduld sowie Übung erfordern, um sie zu beherrschen. Beginnen Sie zunächst mit der Vorbereitung von Deckgläsern, falls eine Immunhistochemie durchgeführt wird; überspringen Sie andernfalls diesen Schritt und beschichten Sie Zellkulturschalen direkt mit ECM. Sterilisieren Sie 12 Millimeter runde Glasdeckgläser, indem Sie sie in Ethanol eintauchen, und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Anschließend wird ein sterilisiertes Deckglas in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte gegeben.
Arbeiten Sie in einer Abzugshaube und geben Sie einen Milliliter extrazelluläre Matrix oder ECM auf die Deckgläser oder den Boden einer Zellkulturplatte, um diese zu beschichten. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation saugen Sie die ECM-Lösung ab und waschen dreimal mit PBS. Ab diesem Zeitpunkt können die beschichteten Platten sofort verwendet oder verpackt und bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius gelagert werden.
Geeignet zur Visualisierung des durchsichtigen Embryos. Syl-Schutzplatten mit widerstandsfähigen schwarzen Hintergründen werden vorbereitet. Gemäß dem Herstellungsprotokoll.
Bereiten Sie die Dissektionswerkzeuge vor, indem Sie eine Minutien-Nadel in einen Nadelaufnehmer einsetzen. Schärfen Sie die Pinzette mit einem Schärfeblock, sobald alles vorbereitet ist. Sammeln Sie den Uterus von einer zeitlich befruchteten Maus, die 8,5 Tage post coitum beträgt.
Legen Sie den isolierten Uterus in eine Schale mit steriler PBS und waschen Sie ihn. Unter einem Dissektionsmikroskop trennen Sie anschließend die einzelnen Deciduas mit einer Schere und einer Pinzette. Entfernen Sie das uterine Bindegewebe durch vorsichtiges Zerreißen, wobei darauf geachtet werden muss, keinen Druck auszuüben, um zu verhindern, dass der Embryo aus der Decidua herausgedrückt wird.
Verwenden Sie eine Pinzette, um das Uterusgewebe vorsichtig auf der dem Plazentaseiten gegenüberliegenden Seite aufzutrennen. Um den im Dottersack eingeschlossenen Embryo freizulegen, greifen Sie mit der Pinzette den Embryo und den Dottersack am Plazentaseitenrand an und entfernen Sie das Uterusgewebe aus der Schale. Anschließend entfernen Sie mithilfe der Pinzette vorsichtig den Dottersack vom Embryo, indem Sie ihn vorsichtig aufreißen.
Legen Sie die Dottersack in ein Eppendorf-Röhrchen, um mittels Pipette die Genotypisierung durchzuführen, nachdem das Embryo durch Zählen der Somiten gestuft wurde. Idealweise befindet sich das Embryo zwischen dem sechsten und zehnten Stadium. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Neuralfalten gerade mit der Hebung, und die wesentliche Morphogenese des kranialen Mesenchyms ist noch nicht erfolgt.
Nach der Bestimmung des Entwicklungsstadiums überführen Sie das Embryo auf eine schwarze Zellfilterplatte, die DMEM ohne Phenolrot enthält. Zuerst unter einem Dissektionsmikroskop mit der höchstmöglichen Vergrößerung das Kopfende des Embryos mit einer Dissektionsnadel in jeder Hand fixieren und den Kopf vor den rmba-Meres dissezieren. Anschließend entlang der Mittellinie bis bi schneiden.
Zerteilen Sie den Kopf mit einer Präpariernadel in jeder Hand in zwei gleiche Hälften. Präparieren Sie die äußeren Ränder entlang der Embryokopfmargin und der Mittellinie. Entfernen Sie nach Bedarf, um eine Verwechslung des gewünschten Explantats mit unerwünschtem Gewebe zu vermeiden.
Explan enthält wanderndes kraniales Neuroektoderm, paraxiales Mesoderm und Oberflächenektoderm, um locker angeheftete Zellen zu entfernen. Vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf- und abpipettieren. Und für Pepin den Explan vorsichtig mit einer Pipettenspitze aufnehmen.
In etwa 10 Mikroliter DMEM in der Mitte einer beschichteten Gewebekultur gut platzieren, 20 Mikroliter warmes DMEM mit 15 % FBS ergänzen, die Kulturschale kann nun in einen Gewebekulturinkubator überführt werden. Nach ungefähr einer bis zwei Stunden ist das Explantat angeheftet und zusätzlich 250 Mikroliter Medium können hinzugefügt werden. Nach ungefähr 24 Stunden wird das Explantat fest am Deckglas befestigt sein.
Zu diesem Zeitpunkt können pharmakologische Wirkstoffe nach weiteren 24 Stunden dem Medium zugesetzt werden; die Zellen wandern anschließend aus diesen aus. Üblicherweise werden Bilder aufgenommen, um die Distanz und Anzahl der Zellen zu dokumentieren, die aus diesen migrieren. Zu diesem Zeitpunkt zeigen die Zellen aufgrund längerer Inkubationen erste Anzeichen einer verminderten Vitalität.
Hier sind Beispiele für Zellen, die aus kranialen Me- und Chix-Pflanzen wandern. Nach 48 Stunden auf verschiedenen Substraten hängen Form und Größe der aus dem Explan wanderten Zellen von der Substratmigration ab, die auf Fibronectin, Laminin, Max-Gel, ECM und Hyaluronsäure unterstützt wurde.
Nach dieser Vorgehensweise können andere Methoden wie die Immunfluoreszenz und die Live-Bildgebung eingesetzt werden, um die Signalwege, die das Verhalten der kranialen Meinkin während der Neuralfalte-Hebung regulieren, weiter zu untersuchen.
Übersicht
Diese Studie stellt einen einfachen ex vivo-Explanten-Assay vor, um die zellulären Verhaltensweisen des kranialen Mesenchyms während der Neurulation zu untersuchen. Der Assay ermöglicht pharmakologische Eingriffe und lebende Bildanalysen und liefert so Einblicke in die morphogenetischen Bewegungen, die zur Hebung der Neuralleisten führen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das kraniale Mesenchym spielt eine entscheidende Rolle bei der Anhebung der Neuralleisten.
- Das Verständnis zellulärer Verhaltensweisen während der Neurulation ist für die Entwicklungsbiologie unerlässlich.
- Ex-vivo-Assays können wertvolle Einblicke in die zellulären Dynamiken liefern.
- Pharmakologische Wirkstoffe können verwendet werden, um diese Verhaltensweisen zu beeinflussen und zu beobachten.
Zweck der Studie
- Charakterisierung der zellulären Verhaltensweisen des kranialen Mesenchyms während der Neurulation.
- Entwicklung eines Assays, der für pharmakologische und bildgebende Untersuchungen verwendet werden kann.
- Untersuchung der Signalwege und der extrazellulären Matrixproteine, die am Verhalten des kranialen Mesenchyms beteiligt sind.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Embryonen aus zeitlich bestimmten schwangeren Mäusen.
- Mikrodissektion von cranialen Mesenchym-Explantaten.
- Kultur der Explantate auf mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platten.
- Durchführung von Live-Bildgebung zur Beobachtung der Zellmigration und des Zellverhaltens.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anheftung und Kultur von kranialem Mesenchym-Explantat.
- Beobachtung von Zellwanderungsmustern, die durch die Zusammensetzung des Substrats beeinflusst werden.
- Identifizierung zentraler Signalwege, die an der Hebung der Neuralfalte beteiligt sind.
- Nachweis der Nützlichkeit des Assays für pharmakologische Studien.
Schlussfolgerungen
- Der ex-vivo-Explanten-Assay ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik des kranialen Mesenchyms.
- Pharmakologische Eingriffe können Einblicke in zelluläre Verhaltensweisen während der Neurulation ermöglichen.
- Diese Methode kann die weitere Erforschung von Entwicklungsprozessen und verwandten Störungen erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieser ex vivo-Explantat-Assay ermöglicht die mechanistische Untersuchung von Verhaltensweisen des kranialen Mesenchyms während der Neurulation und unterstützt die Zielvalidierung in Entwicklungsprozessen. Durch die Quantifizierung der Zellmigration auf definierten ECM-Substraten liefert er eine vorhersagbare Sicherheit zur Absicherung von Hypothesen über morphogenetische Triebkräfte der Neuralrohrenbildung. Die Verträglichkeit des Assays mit pharmakologischen Störungen und Live-Bildgebung positioniert ihn als translationsbrücke zwischen der Entdeckungsbiologie und präklinischem Modellieren neuroentwicklungsbiologischer Prozesse.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem das kraniale Mesenchym isoliert wird, um die spezifischen Beiträge einzelner Signalwege zur Hebung der Neuralleiste zu klären.
- Operativer Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch funktionelle Validierung mesenchymaler Zellverhalten in einem krankheitsrelevanten System.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem Wechselwirkungen zwischen ECM-Substraten und migratorischen Phänotypen verknüpft werden, die die Zielvertrauenswürdigkeit beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem die Anheftung von Explantaten und die Auswanderung standardisiert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit des Assays durch definierte Kulturbedingungen und quantitative Auswertungen auf Fibronectin, Laminin, Matrigel, ECM und Hyaluronsäure.
- Strategischer Wert: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und die Wiederverwendbarkeit der Plattform zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf mesenchymale Migrationsdynamiken.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch die Übereinstimmung mit Neurulationsdefekten und das translationsmedizinische Biomarker-Potenzial in migrierenden Zellpopulationen.
- Operationaler Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem lebendige Bildgebung und pharmakologische Untersuchung von Signalwegen ermöglicht werden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem zelluläre Verhaltensweisen gemessen werden, die morphogenetische Ergebnisse bei der Schließung des Neuralrohrs vorhersagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für den Entdeckungsprozess von der frühen Entdeckung bis zur Leitstruktur-Identifizierung und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Aufklärung von Signalwegen in Entwicklungsbiologie-Pipelines.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie das kraniale Mesenchym isoliert, um Signalwege zu untersuchen, die mesenchymale Umordnungen antreiben.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays durch standardisierte Explantenkultur auf ECM-beschichteten Platten sowie die quantitative Messung der Zellwanderungsdistanz und -anzahl.
- Analysen: Hebt Messgrößen wie die Anzahl wandernder Zellen und morphologische Veränderungen hervor, die einen Vergleich zwischen Bedingungen unter pharmakologischen oder Substrat-Variablen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie Live-Bildgebung und pharmakologische Studien ermöglicht, die Modelle von Neurulationsdefekten informieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, um mesenchymal-ECM-Interaktionen bei mehreren neurodevelopmentalen Zielstrukturen zu untersuchen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei der mesenchymalen Morphogenese.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Explantat-Assays auf definierten ECM-Substraten.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und verringertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen neurodevelopmentaler Programme.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf quantitativen Migrationsphänotypen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in embryonaler Dissektion und Mikrodissektionstechniken.
- Instrumentelle und analytische Infrastruktur für Live-Bildgebung und den Umgang mit pharmakologischen Verbindungen.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich der Explantatpräparation und der Konsistenz der ECM-Beschichtung.
- Anpassungsüberlegungen bei verschiedenen Modellsystemen aufgrund artenspezifischer mesenchymaler Zusammensetzung und Entwicklungsstadien.
- Praktische Einschränkungen, einschließlich der Gewebeviabilität über 48 Stunden hinaus und der Abhängigkeit von einer präzisen somitenbasierten embryonalen Stadieneinteilung.
