High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA-Sonden mithilfe einer Chromosomenpräparation unter hohem Druck an Polytänchromosomen von Mücken zu koppeln, gefolgt von einer automatisierten fluoreszenten in-situ-Hybridisierung und automatisierten Bildgebung. Dies wird erreicht, indem zunächst Polytänchromosomenpräparationen mit einer Methode unter hohem Druck erstellt werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, fluoreszierende Sonden herzustellen, indem genomische DNA mittels eines Nick-Übersetzungsprotokolls mit einem Fluorochrom markiert wird.

Der dritte Schritt besteht darin, eine fluoreszente in-situ-Hybridisierung unter Verwendung automatisierter Objektträger-Färbungssysteme durchzuführen. Der letzte Schritt ist das Scannen und Fotografieren markierter Chromosomen mittels eines automatischen fluoreszenzbasierten Bildgebungssystems. Letztendlich können die Bilder die Lokalisation einer fluoreszenzmarkierten DNA-Sonde am Polychromosom zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie einem standardmäßigen manuellen In-situ-Hybridisierungsprotokoll, liegt darin, dass das Hochdurchsatz-physikalische Kartierungsprotokoll konsistentere Ergebnisse liefert und die manuelle Arbeitszeit erheblich verkürzt. Dieses Protokoll beginnt damit, dass halbe Gravitations- und Oly-Weibchen etwa 25 Stunden nach der Blutmahlzeit seziert werden, um ihre Ovarien im Christopher-Stadium drei zu sammeln. In diesem Stadium sollte der transparente Bereich mit den Nährzellen innerhalb der Follikel eine runde Form aufweisen. Sammeln Sie Ovarien von fünf Weibchen und fixieren Sie sie in 500 µL frisch hergestellter modifizierter Car-Noise-Lösung.

Sie können dann bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur oder länger bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie anschließend unmittelbar vor der Herstellung von Ovarpräparaten die Carnoysche Lösung und 50 %ige Propionsäure vor. Geben Sie jedes Ovarpaar in einen Tropfen frischer Carnoyscher Lösung auf einem staubfreien Objektträger unter einem Stereomikroskop.

Teilen Sie die Eierstöcke mit der Präpariernadel. Überführen Sie alle Eierstockstücke auf sechs saubere Objektträger mit 50 % Propionsäure. Trennen Sie die Follikel untereinander mithilfe von Präpariernadeln voneinander.

Danach alle verbleibenden Gewebestücke mit einem Papiertuch abwischen. Einen weiteren Tropfen 50% Proponic acid hinzufügen und drei bis fünf Minuten warten. Nachweislich verbessert die Einwirkung der Follikel auf 50% Proponic acid für drei bis fünf Minuten signifikant die Chromosomenausbreitung.

Als Nächstes ein Deckglas aufsetzen und weitere Minute warten, um die Kerne zu verteilen. Die Objektplatte mit Filterpapier und Plastik umwickeln. Ein Dremel auf zwischen 3.000 und 5.000 U/min einstellen und etwa eine Minute lang die rotierende Dremel-Spitze leicht gegen das Deckglas kreisen lassen.

Überprüfen Sie die Ausbreitungsqualität mit einem Phasenmikroskop und wenden Sie den Dremel gegebenenfalls länger an, um die Chromosomen zu glätten. Platzieren Sie einen zweiten Deckelobjektträger neben dem ersten und betten Sie die Deckelobjektträger durch einen weiteren Mikroskopobjektträger ein. Wickeln Sie die Objektträger anschließend mit einer Plastikfolie und Filterpapier ein, und legen Sie die verpackten Objektträger in einen Schraubstock, um sie auf 85 bis 120 Zollpfund zu komprimieren.

Nachdem die Chromosomen auf allen sechs Objektträgern abgeflacht wurden, nehmen Sie die Objektträger aus der Verpackung und entfernen Sie die zusätzlichen Objektträger, um die Chromosomen weiter zu entfalten. Inkubieren Sie die Objektträger 10 bis 15 Minuten lang bei 55 Grad Celsius in einem System zur Denaturierung und Hybridisierung von Objektträgern. Tauchen Sie anschließend einen Objektträger mindestens 15 Sekunden lang oder bis zum Ende der Blasenbildung in flüssigen Stickstoff ein.

Entfernen Sie dann schnell die Deckglas mit einem Rasiermesser und legen Sie die Probe sofort für fünf Minuten in kalten 50 %igen Ethanol. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe nacheinander. Dehydrieren Sie die Proben durch eine Reihe von Ethanolbädern mit 70 %, 90 % und 100 % Ethanol.

Legen Sie sie in jedes Bad für fünf Minuten ein. Schließlich, nachdem die Objektträger an der Luft getrocknet sind, sind sie bereit für die FISH-Färbung. Eine automatisierte Vorrichtung führt die meisten Schritte des Verfahrens durch, mit Ausnahme der Sondemarkierung.

Bevor Sie das Gerät beladen, bereiten Sie die fluoreszierende Sonde vor, indem Sie die DNA mit dem Fluorochrom gemäß einem kommerziellen NIC-Übersetzungsprotokoll markieren. Nachdem die Sonde hergestellt ist, laden Sie die Objektträger und Reagenzien in das automatisierte System für Objektträger und programmieren Sie das System, die folgenden Schritte durchzuführen. Zuerst geben Sie 800 Mikroliter eines 1x PBS für 20 Minuten zu.

Zweitens die Objektträger trocken föhnen. Drittens die Objektträger mit 450 µL 4 % Formalin in 1× PBS für eine Minute fixieren. Anschließend die Objektträger zweimal für jeweils eine Sekunde und einmal für zwei Minuten mit 100 % Ethanol waschen.

Nach dem Ethanoleinsatz die Objektträger erneut mit einem Gebläse trocknen. Anschließend die Objektträger zur Vermeidung von Blasenbildung zwei Minuten lang bei 45 Grad Celsius erhitzen. Danach 20 Mikroliter der DNA-Sonde auftragen, gefolgt von einem Tropfen Paraffinöl und einem Deckglas. Danach die Chromosomen bei 90 Grad Celsius zehn Minuten lang behandeln.

Dann die Objektträger für 14 Stunden bei 42 Grad Celsius hybridisieren lassen. Nach der Hybridisierung die Stringenzwäschen zweimal für jeweils zwei Minuten bei 42 Grad Celsius durchführen, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden einsekündigen Anwendungen von zwei XSSC und Trocknen. Anschließend zweimal je 800 Mikroliter 0,4 XSSC bei 42 Grad Celsius für 10 Minuten zugeben, gefolgt von einer weiteren Wäsche und einer Wäsche mit zwei XSSC bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten.

Tragen Sie nun 50 Mikroliter Yo-Yo-1-Färbemittel auf, gefolgt von Mineralspindel und Deckgläsern. Inkubieren Sie die Objektträger bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend entfernen Sie die Deckgläser.

Die Objektträger viermal jeweils eine Sekunde lang in zwei XSSC waschen und die Objektträger anschließend trockenblasen. Abschließend 15 Mikroliter eines prolongierten Gold-Anti-Fade-Reagenz auf jeden Objektträger geben und neue Deckgläser aufsetzen. Das automatisierte Scansystem Accord plus einschalten, beginnend mit der Olympus U-R-F-L-T-Netzversorgung für eine Halogenlampe.

Danach der Computer und schließlich das Mikroskop mit einer Kameraanbindung. Öffnen Sie nun zuerst das Duet-Softwarepaket, richten Sie eine 10×-Vorscan-Einstellung ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Online“, geben Sie eine neue Fall-ID ein und weisen Sie eine Objektträger-ID zu.

Klicken Sie auf den Punkt mit der Bezeichnung bf. Dies ist die Hellfeld-Option. Wählen Sie eine Scan-Option für den Vorscan mit 10×.

Wählen Sie 2, 500 x Kreis, 10.000 x Kreis oder Rechteck. Klicken Sie auf „Setzen“ und „Ausführen“. Befolgen Sie dann die Aufforderungen, um den Scanvorgang korrekt anzupassen, und klicken Sie anschließend auf „Fertig“.

Um den Scan zu starten, drücken Sie die Haupt-Registerkarte, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie nun auf die Offline-Schaltfläche, suchen Sie die zugewiesene Fall-ID und Objektträger-ID und klicken Sie auf Offline.

Scannen Sie das schwarze Feld im oberen linken Bereich ein. Klicken Sie auf einen Pfeil und wählen Sie 10x-Vorscan. Verwenden Sie die Pfeile, um nach dem Auffinden eines interessanten Bildes durch die gescannten Bilder zu navigieren.

Doppelklicken Sie auf den Bildschirm in der Mitte des Zielbereichs und drücken Sie „Snap“. Dadurch wird ein Bild für die Aufnahme festgelegt, nachdem alle Ziele ausgewählt wurden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jedes Bild, wählen Sie „Classify“, dann „10x Pre-Scan“ und anschließend „Polytan“.

Zurück zum Hauptmenü und Einrichten des 40×-Vorscans. Wählen Sie erneut Online und wählen Sie einen Objektträger aus. Ändern Sie HFD in ffl und ändern Sie den Aufgabennamen in erneuter Besuch Strich X 40 Strich rg.

Ändern Sie den Abschnitt direkt unter der letzten Einstellung, um alle Striche erneut zu besuchen. Führen Sie dann das Programm aus und folgen Sie den Anweisungen. Um die Automatisierung einzurichten, klicken Sie auf die Schaltfläche „Start Matching Views“, um die Bilder mit 10× und 40× zu vergleichen.

Klicken Sie auf „Fertig stellen“, um den Scan zu starten. Danach klicken Sie auf „Klassifizieren“ und betrachten die Bilder. Präparationen von Polytänchromosomen aus ovarialen Pflegezellen weiblicher Anomalie-Gambia wurden mit der Hochdrucktechnik hergestellt.

Diese Methode beschädigt oder verändert die meisten Chromosomenstrukturen nicht. Sie glättet gebogene Chromosomen und macht dadurch versteckte Feinbanden sichtbar, die auf herkömmlichen Präparationen nicht zu erkennen sind. Das Chromosom wurde mit rückwärts gerichteten DNA-Klonen aus der Anomalie S Gambia nd Tam Rückbibliothek sondiert.

Die Bibliothek wurde aus männlichen und weiblichen ersten Stern-Larven des Anomalie-S.-gambiae-Peststammes erzeugt. Mithilfe dieses Verfahrens kann eine automatisierte, hochdurchsatzfähige physikalische Kartierung durchgeführt werden, um die schnelle Entwicklung chromosomenbasierter Genom-Assemblys zu erleichtern.