Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Signalwege zu identifizieren, die Veränderungen der funktionellen Beta-Zellmasse regulieren. Dies wird in isolierten Ratten-Inseln erreicht, indem die Expression eines Gens mittels adenoviraler Vektoren überexprimiert oder unterdrückt wird. Nach dieser Manipulation wird die Funktion der Beta-Zellen anhand der Insulinsekretion beurteilt und die Inselzellreplikation durch die Inkorporation von tritiiertem Thymidin gemessen.

Schließlich können diese Assays zeigen, ob ein Gen der Interesse die Proliferation und/oder Funktion von Beta-Zellen in vitro reguliert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Augenlidbiologie zu beantworten, beispielsweise ob eine bestimmte Komponente eines Signalwegs das Wachstum und die Funktion von Beta-Zellen beeinflusst. Bereiten Sie eine sechsfach nicht mit Gewebekultur beschichtete Platte vor, indem Sie zwei Milliliter modifiziertes Medium in die erforderliche Anzahl von Vertiefungen geben.

Beispielsweise kann ein typisches Experiment drei Vertiefungen erfordern, jeweils eine für eine Kontrolle ohne Virus, eine Virus-Kontrolle und die experimentelle Gruppe. Erwärmen Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang in einem Zellkultur-Inkubator auf 37 Grad Celsius. Unmittelbar nach der Isolierung der Ratten-Augenlöcher werden jeweils ein bis 200 Augenlöcher in jede Vertiefung der vorbereiteten Platte gegeben. 60 Augenlöcher werden für biochemische Assays verwendet, die verbleibenden Augenlöcher können für Genexpressionsstudien oder Immuno-Blotting genutzt werden. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Augenlöcher in die Mitte jeder Vertiefung zu bringen.

Pipettieren Sie das Adenovirus anschließend unverzüglich direkt auf die Ösen in der Mitte der Schale. Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion von 1 bis 500, abhängig von der Wirksamkeit des Adenovirus bei der Überexpression oder Herunterregulierung Ihres Proteins von Interesse.

Eine effiziente adenovirale Penetration bis zum Kern des Augenlids erhöht die Konsistenz der Ergebnisse. Die Transduktion der Augenlider unmittelbar nach der Isolierung des Augenlids ist entscheidend.

Stören Sie die Platte fünf Minuten lang nicht, dann bringen Sie sie für 24 Stunden in den Inkubator. Am nächsten Tag nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und quellen die Öhrchen vorsichtig auf die Zentren der Vertiefungen auf. Überführen Sie die Öhrchen mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette in eine neue Vertiefung, die frisches Medium enthält.

Wenn die Augenlöcher mit der Platte verkleben, können sie vorsichtig mit der Pipettenspitze gelöst werden. Es ist hilfreich, ein Kontrollvirus, das GFP exprimiert, zu verwenden, um die ausreichende Transduktionseffizienz mittels konfokaler Mikroskopie zu überprüfen und die Penetration des Adenovirus in die Inselzellkultur zu visualisieren. Die Inseln werden für ein bis drei weitere Tage kultiviert, wobei das Medium täglich gewechselt wird.

Die Kulturdauer muss anhand von Vorstudien optimiert werden und variiert je nach den experimentellen Zielen. Fügen Sie für die letzten 24 Stunden tritiertes Thymidin in das Medium mit einer Konzentration von einem Mikrocurie pro Millimeter Medium hinzu. Bereiten Sie zunächst frisch 50 Milliliter des Arbeits-SAB in einem 50-Milliliter-Konischgefäß vor und erwärmen Sie es in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Pipettieren Sie 10 Milliliter des arbeitsfertigen SAB in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und geben Sie 66,8 Mikroliter 2,5-molarer D-Glucose hinzu. Um das SAB mit hohem Glucosespiegel herzustellen, geben Sie 44,8 Mikroliter 2,5-molarer D-Glucose zu den verbleibenden 40 Millilitern des arbeitsfertigen SAB. Um das SAB mit niedrigem Glucosespiegel herzustellen, beschriften Sie zunächst drei 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Für jede Vertiefung der sechsstelligen Platte geben Sie einen Milliliter PBS in jedes Röhrchen. Vergessen Sie nicht, den institutionellen Vorschriften für die Handhabung und Entsorgung der radioaktiven Augenringe zu folgen. Wählen Sie mithilfe eines Stereomikroskops oder eines herkömmlichen Mikroskops 20 vergleichbar große Augenringe aus und überführen Sie diese in jedes Mikrozentrifugenröhrchen.

Beispielsweise kann jedes Reagenzglas fünf kleine, zehn mittlere und fünf große Augen enthalten. Obwohl die Ergebnisse am Ende des Experiments auf den Gesamtgehalt an Protein normalisiert werden, ist es entscheidend, die Augen zwischen den Gruppen nach Größe zu vergleichen. Nachdem man den Augen ermöglicht hat, sich durch Schwerkraft oder Zentrifugation am Boden des Reagenzglases abzusetzen, aspirations das PBS mit einer Mikropipette, wiegt es ab und fährt dann mit der Vorbereitung der Augen für die biochemischen Assays fort.

Um die Augenlöcher für den Insulinsekretionsassay vorzubereiten, müssen sie zunächst mit SAB mit niedrigem Glucosespiegel vorinkubiert werden. Dazu 400 Mikroliter des SAB mit niedrigem Glucosespiegel in die Röhrchen geben und diese mit verschlossenen Deckeln eine Stunde lang in den Zellkulturinkubator stellen. Nach einer Stunde das vorinkubierte SAB mit niedrigem Glucosespiegel abpipettieren, um die basale Insulinsekretion zu messen. Wiederholen Sie den Vorinkubationsschritt erneut.

Um jedoch die stimulierte Insulinsekretion zu messen, verwenden Sie 400 Mikroliter SAB mit hohem Glucosespiegel anstelle von SAB mit niedrigem Glucosespiegel und inkubieren Sie die Augenringe wie zuvor 60 Minuten lang. Nach der Inkubation in entweder SAB mit hohem oder niedrigem Glucosespiegel pipettieren Sie das SAB ab und verwenden es für die Insulin-Radioimmunassay, die gemäß der Herstellerprotokoll durchgeführt wird. Fahren Sie anschließend mit dem Thymidin-Einbau-Assay unter Verwendung derselben Augenring-Sammlung fort. Beginnen Sie mit den Augenringen, die gerade für den Insulinsekretions-Assay verwendet wurden.

Geben Sie einen Milliliter PBS hinzu und lassen Sie die Ösen durch Schwerkraft absetzen. Danach saugen Sie das PBS mit einer Mikropipette ab. Entsorgen Sie das abgesaugte Medium und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.

Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter eiskalte Trichloressigsäure zu den Augenlöchern hinzu und inkubieren Sie diese 30 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius. Danach aspirationsbedingt die TCA verwerfen.

Fügen Sie anschließend 80 µL 0,3 normaler Natronlauge hinzu und inkubieren Sie die Augenlöcher 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während dieser Inkubation wirbeln Sie die Proben alle 10 Minuten kräftig 5 bis 10 Sekunden lang im Vortex. Parallel dazu geben Sie vier Milliliter eines Conno-Safe-Zählcocktails in Sieben-Milliliter-Flüssigszintillationszählerrohre.

Nach Beendigung der Inkubation der Ösen fügen Sie 50 Mikroliter der Ösen einem Szintillationsröhrchen hinzu. Schütteln Sie das verschlossene Röhrchen kurz und messen Sie die Radioaktivität der Proben in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler. Um außerdem die Proteinkonzentration zu bestimmen, übertragen Sie 10 Mikroliter Vilas in einen kommerziellen Bionsäure-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.

Später während der Datenanalyse normalisieren Sie die Ergebnisse anhand der Protein­konzentration unter Verwendung der beschriebenen Protokolle. Augenringreplikation und Beta-Zell-Funktion. Bei Ratten wurde durch eine adenovirale Überexpression des hypothetischen Gens sechs eine robuste Stimulation der Augenringreplikation ohne Veränderung der Beta-Zell-Funktion nachgewiesen.

Erhöhte Expression des Gens sechs, erhöhte DNA-Synthese, gemessen an der Inkorporation von Thymidin, da die meisten Zellen im Ratten-Augenöhrchen Beta-Zellen sind. Weitere Experimente könnten zeigen, dass die erhöhte Thymidininkorporation auf eine vermehrte Replikation der Beta-Zellen zurückzuführen ist. Der Insulinsekretions-Assay zeigte, dass die Überexpression des Gens sechs eine der Hauptfunktionen der Beta-Zellen – die Insulinsekretion bei niedrigem und hohem Glukosespiegel – nicht verändert hat.

Der Anstieg der Insulinsekretion bei niedrigen und hohen Glukosekonzentrationen spiegelt die Gesundheit der Inseln nach der Behandlung mit Adenovirus wider. Wenn eine erhöhte Expression des Gens sechs die Betazellenfunktion beeinträchtigen würde, würde sich dies vermutlich als Verringerung der bei hohen stimulierenden Glukosekonzentrationen freigesetzten Insulinmenge zeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Replikation von Betazellen und die Insulinsekretion misst, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Gen das Wachstum oder die Funktion von Betazellen beeinflusst.