High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Anwendungen, die Zellen in kleinen, im Pikoliter-Bereich liegenden Tropfen nutzen, wurden häufig durch die Unfähigkeit eingeschränkt, die Anzahl der Zellen pro Tropfen zu kontrollieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Steuerung der Zellenkapselung, die zwei unterschiedliche mikrofluidische Phänomene kombiniert: die fluiddynamische Ordnung von Zellen und die Tropfenbildung an einer strömungsfokussierenden Mikrodüse. In einem vorgeschalteten Kanal wird eine ausreichend hohe Strömungsgeschwindigkeit einer wässrigen Lösung mit suspendierten Zellen oder Partikeln bereitgestellt, um die Bildung von Zellzügen mit gleichmäßigem Abstand in Strömungsrichtung stromabwärts zu bewirken.

Mittels einer Strömungsfokussier-Drop-Generier-Düse werden wässrige Tropfen mit einer Frequenz im Kilohertz-Bereich in einer tensidstabilisierten, verträglichen öligen Trägerflüssigkeit erzeugt. Anschließend werden die geordneten Zell- beziehungsweise Partikelzüge durch Abstimmung der wässrigen und öligen Durchflussraten mit der Tropfenbildung kombiniert, sodass die Rate der Tropfenbildung mit der Ankunft der längsgeordneten Zellen oder Partikel an der Tropfenbildungs-Düse synchronisiert ist, wobei Partikel als Ersatzstoffe für Zellen verwendet werden. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, müssen die Durchflussraten ausreichend gering sein, um die Fluidströmung zu begrenzen.

Scherbelastungen auf biologische Zellen, die Überlappung der zellulären Ordnung, Tropfengenerierung und Zellviabilität. Die Beschränkungen der wässrigen Durchflussrate bieten ein ideales Betriebsregime für die gezielte Einschließung einzelner und mehrerer Zellen. Die Analyse von Videomikroskopiedaten zeigt, dass die Effizienzen sowohl der Einzel- als auch der Doppelzell- oder Teilcheneinschließung über den zufälligen Einschließungseffizienzen liegen und die Anzahl der Tropfen, die nicht die gewünschte Anzahl an Zellen oder Teilchen enthalten, erheblich reduzieren.

Die Einschränkung von Zellen und Tröpfchen begrenzt die Verdünnung von Zellsekreten, verdeutlicht die Heterogenität der Zellen und ermöglicht zudem die Kontrolle von interzellulären Signalen im Vergleich zu einer makroskopischen Suspension. Effiziente Methoden zur Verkapselung dieser Zellen in Tröpfchen stellen ein wertvolles Werkzeug für biologische Forscher dar. Um dieses Verfahren zu beginnen, entwerfen Sie ein Mikrokanalmuster wie in dieser Abbildung gezeigt mit der AutoCAD-Software.

Der lange Kanalabschnitt stellt den wässrigen Flussordnungskanal mit einer Breite von 27 Mikrometern dar. Das vergrößerte Düsen-Schema zeigt gleiche Kanalbreiten von 27 Mikrometern für den wässrigen Ordnungskanal und den Ölkanal, gefolgt von der Düsenverengung auf 22 Mikrometer und einer plötzlichen Erweiterung zu einem breiteren 61-Mikrometer-Kanal. Die Gerätehöhe beträgt 52 Mikrometer.

Sowohl der wässrige als auch der Öleinlass verfügen über große Schmutzfilter mit Spalten in der Größenordnung der Breite des Ordnungskanals, wie durch dieses vergrößerte Schema des Öleinlasses veranschaulicht. Gezeigt ist ein echtes Bild des Ordnungskanals und der Düse, die mit Farbstoff injiziert wurden. Beauftragen Sie einen externen Hersteller, eine hochauflösende Transparenzmaske auf Mylar-Folie oder Quarz zu drucken, wobei die Kanäle auf dunklem Hintergrund transparent sind.

Erstellen Sie anschließend eine Silizium- und SU-8-Photoresist-Masterform für das Abformverfahren. Befestigen Sie die Masterform mit Klebeband an der Unterseite einer Petrischale für die PDMS-Abformung. Nach Abschluss der Abformung und Ausschneidung der Gerätekontur verwenden Sie eine Biopsiepunch mit 0,75 mm Außendurchmesser, um in den drei runden Bereichen, die in dieser Abbildung gezeigt sind, Fluidikanschlüsse zu stanzen. Kleben Sie ein Stück Tesafilm auf die strukturierte Seite des PDMS und ziehen Sie es ab, um nach der Plasmabehandlung Staubpartikel zu entfernen.

Das PDMS auf einen sauberen Glasobjektträger geben. Das gesamte Gerät in einen Ofen stellen und den Ofen schrittweise auf 120 Grad Celsius erwärmen. Das Gerät über Nacht bei 120 Grad Celsius im Ofen belassen, um die Bindung abzuschließen und das PDMS in seinen ursprünglichen hydrophoben Zustand zurückzuversetzen.

Eine alternative Methode, um die Glasoberfläche des Kanals hydrophob zu machen, besteht darin, eine Beschichtung wie aquae in die fluidischen Anschlüsse einzuspritzen und anschließend mit Luft zu spülen. Ziehen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer Spritze-Nadel mehrere hundert Mikroliter Luft ein, gefolgt von einer geringen Menge an aquil, ausreichend, um lediglich die metallische Spritzen-Spitze zu füllen. Injizieren Sie vorsichtig, aber fest das aqua, gefolgt von der spülenden Luft, in die fluidischen Anschlüsse, ohne die PDMS-zu-Glas-Verbindung zu beschädigen.

Wiederholen Sie die Luftentlüftung an allen Einlass- und Auslassöffnungen, während Sie überschüssiges Wasser abwischen, um Ablagerungen zu vermeiden, die die Kanäle beim Trocknen verstopfen könnten. Die Kontrolle der Zellkonzentration ist entscheidend, um die richtige Anzahl von Zellen auf die richtige Anzahl von Tropfen abzustimmen. Dies umfasst zwei herausfordernde Aspekte.

Die erste Herausforderung besteht darin, die geeignete Konzentration im Voraus abzuschätzen, die zweite darin, diese Konzentration während des Experiments aufrechtzuerhalten. Für das in dieser Studie verwendete Gerät sollten acht bis 15 Mikrometer große Zellen oder Partikel ausreichend sein, um eine geordnete Anordnung für eine kontrollierte Einschließung zu erreichen. In dieser Demonstration werden 9,9-Mikrometer-Polysulfid-Mikrokugeln als Zellmodelle verwendet, um die wässrige Partikelsuspension vorzubereiten. Um eine ideale Einschließung zu erreichen, beginnen Sie mit einer Ausgangskonzentration der Mikrokugeln von 1 % Feststoffen nach Gewicht, basierend auf früheren Daten für eine vollständige Ordnung. Als Richtwert erhöhen Sie die Konzentration auf 1,5 % Feststoffe, indem Sie ein Milliliter der Ausgangssuspension vorsichtig zentrifugieren, 250 Mikroliter der überstehenden Flüssigkeit abpipettieren und die Partikel durch Vortexmischen oder sanftes Mischen resuspendieren.

Bei Verwendung von Zellen haben sowohl Zellen als auch Polystyrolpartikel eine Dichte größer als eins, obwohl dies in diesem Video nicht gezeigt wird. Für Langzeitexperimente, die mehrere Minuten bis Stunden dauern, kann die Lösung durch Zugabe eines Lösungsmittels wie Calciumchlorid für Partikel oder OptiPrep für Zellen dichteangepasst werden. Nachdem die Zell- oder Partikelsuspension bereit ist, bereiten Sie eine 10-Milliliter-Probe der kontinuierlichen fluorkohlenstoffhaltigen Ölphase in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen durch Wirbelmischen vor.

Vermischen Sie das Tensid und das Fluorkohlenwasserstofföl zu etwa 2,5 % Gewicht pro Gewicht. Hier erhalten wir eine Mischung von 2,4 Gewicht pro Gewicht, die zum Einrichten des Mikroverkapselungsversuchs akzeptabel ist. Schalten Sie zunächst die Stromzufuhr für das invertierte optische Mikroskop und die Hochgeschwindigkeitskamera ein.

Konzentrieren Sie sich auf die Mikrokanalschicht und untersuchen Sie die Kanäle auf Verstopfungen und jegliche Ablagerungen, die sich lösen könnten. Wählen Sie einen Kanal ohne große Ablagerungen oder offensichtliche Verstopfungen aus. Schneiden Sie drei Stücke durchscheinenden Tigon-PVC-Schlauchs für den wässrigen Zulauf, den Ölzulauf und den Emulsionsablauf zu, um das Totvolumen zu minimieren.

Schneiden Sie ein Stück Schlauch zu, das gerade ausreicht, um von den Spritzenpumpen zum Mikroskop zu reichen. Schneiden Sie die Enden des Schlauchs in einem Winkel von 45 Grad zu, um die Einführung in die fluidischen Anschlüsse zu erleichtern. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Schlauchenden in die fluidischen Anschlüsse einzupressen. Anschließend wird eine stumpfe Kanüle aus rostfreiem Stahl mit 30 Gauge in das freie Ende des wässrigen Zulaufschlauchs eingepresst.

Wiederholen Sie dies für das Öl-Zulaufrohr. Bewegen Sie das Gerät und befestigen Sie die Schläuche am Mikroskopständer. Richten Sie das Objektiv mit 20-facher Vergrößerung aus und fokussieren Sie auf die Düse des Geräts. Stellen Sie das Mikroskop manuell auf Köhler-Beleuchtung ein, um eine optimale Beleuchtung in der Fokusebene zu gewährleisten.

Verwenden Sie die Beschneide-Funktion der Hochgeschwindigkeitskamera-Software, um den Sichtbereich um die Düse zu verkleinern und so höhere Bildraten zu ermöglichen. Stellen Sie anschließend die Bildrate, Belichtungszeit und andere Kameraeinstellungen gemäß den Anforderungen für eine optimale Aufnahme ein. Füllen Sie danach eine Ein-Milliliter-Spritze mit der zuvor hergestellten, gut vermischten wässrigen Phasenlösung. Befüllen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit der Ölphasenlösung.

Stellen Sie eine der gefüllten Spritzen senkrecht auf und klopfen Sie leicht, um Luftblasen zum Auslass der Spritze zu bewegen. Drücken Sie den Kolben langsam so lange nach unten, bis die Luft an die Spitze der senkrecht gehaltenen Spritze befördert ist. Verbinden Sie die Spritze mit der jeweiligen Spritzennadel, die bereits am Gerät befestigt ist.

Drücken Sie den Kolben, um die Luft durch das Totvolumen der Spritzennadel zu pressen, bis die Flüssigkeit fast bis zur Vorrichtung durch die Schläuche gedrückt wird. Befestigen Sie die Spritze sicher an einer Spritzenpumpe und bringen Sie den Kolbenhalter in Betrieb. Wiederholen Sie die Verbindungen für die zweite Spritze und befestigen Sie sie an einer zweiten Spritzenpumpe. Schalten Sie jede Spritzenpumpe ein und programmieren Sie sie. Stellen Sie gemäß den Herstellervorgaben die anfänglichen Fließgeschwindigkeiten auf 50 µL/min für die Ölphase und 5 µL/min ein.

Bei der wässrigen Phasenstartung warten die Pumpen, bis jede Flüssigkeit das Gerät betreten und die Kanäle gefüllt hat, wodurch die restliche tote Luft verdrängt wird. Dies kann mehrere Minuten mit den anfänglichen Durchflussraten in Anspruch nehmen. Beobachten Sie die Bildung von Tropfen an der Düse.

Erhöhen Sie langsam die Durchflussrate der wässrigen Phase, um die Anordnung der Partikel im langen Kanal für die wässrige Lösung zu beobachten. Steigern Sie die Durchflussrate nicht so weit, dass es an der Düse zum Ausströmen (Jetting) des wässrigen Fluidstroms kommt, wie in diesem Beispiel gezeigt; bei Verwendung einer anderen Tropfenbildungs-Düse beachten Sie, dass hier instabiler Fluss und inkonsistente Tropfenbildung vorliegen. Wenn die Partikelkonzentration zu gering ist, um abwechselnde Partikelzüge mit relativ wenigen fehlenden Partikeln zu erzeugen, und wenn die Probe nicht auf Schwerelosigkeit abgestimmt wurde, neigen Sie die Spritzenpumpe physisch in Richtung des Spritzenauslasses, um ein allmähliches Absinken der Partikel in Richtung der Spritzenauslässe zu ermöglichen.

Wenn eine ausreichende Ordnung erreicht ist, stellen Sie die Ölflussrate ein, um Frequenz und Größe der Tropfen zu optimieren. Passen Sie iterativ beide Flussraten an, um die gewünschten Einschlussraten und Tropfenvolumina zu erreichen. Sobald eine stabile, geordnete Einschließung bestätigt ist, bringen Sie das Auslassrohr vom Abfallreservoir in ein Sammelreservoir für die spätere Verwendung.

Eine Einzel- oder Doppelkapselung von Partikeln oder Zellen kann mit hoher Effizienz erreicht werden. Die hier gezeigte Anwendung dieses Protokolls stellt ein repräsentatives Ergebnis der Einzelkapselung von Partikeln mit einer Ölflussrate von 60 Mikrolitern pro Minute und einer wässrigen Flussrate von neun Mikrolitern pro Minute dar. Lambda, die durchschnittliche Anzahl von Partikeln pro Tropfen, beträgt 0,95.

Der Partikelabstand in Strömungsrichtung beträgt bei vollständig geordneten, abwechselnden Partikeln etwa 17 bis 18 Mikrometer. Die Tropfenbildungsrate in diesem Beispiel liegt bei 6,1 Kilohertz mit einer durchschnittlichen Tropfengröße von 24,4 Pikrolitern. Das Histogramm vergleicht die Tropfen-Einschluss-Partikeleffizienz bezüglich der Einschlussrate einzelner Partikel mit Plus.

Bei der Statistik ergibt die zufällige Einschließung bei einer Stichprobengröße von 517 Tropfen einen durchschnittlichen Anteil von 79,5 % Tropfen, die ein Teilchen enthalten, im Vergleich zu einem vorhergesagten zufälligen Einschließungsanteil von 36,7 %. Der Anteil der Teilchen, die in korrekt eingeschlossenen Tropfen endeten, betrug 83,7 % bei einer Stichprobengröße von 491 Teilchen, während der zufällige Einschließungsanteil bei 37,3 % lag. Die Einschließung von zwei Teilchen wird einfach erreicht, indem die Ölflussrate auf 30 Mikroliter pro Minute verringert wird, während die wässrige Flussrate bei neun Mikrolitern pro Minute gehalten wird. Hier beträgt Lambda, die durchschnittliche Anzahl von Teilchen pro Tropfen, 1,8. Ähnlich wie bei der Einschließung einzelner Teilchen.

Der Partikelabstand in Fließrichtung beträgt bei vollständig geordneten, abwechselnden Partikeln etwa 17 bis 18 Mikrometer. Die größeren Tropfen weisen eine durchschnittliche Tropfengröße von 39,8 Pikrolitern auf und entstehen mit einer Rate von 3,8 Kilohertz im Vergleich zur zufälligen Einschließung. Bei einer Stichprobengröße von 383 Tropfen liegt der durchschnittliche Anteil geordneter Einschließungstropfen, die zwei Partikel enthalten, bei 71,5 %, während der vorhergesagte Anteil bei zufälliger Einschließung bei 26,8 % liegt. Der Anteil der Partikel, die sich in korrekt eingeschlossenen Tropfen befanden, wurde bei einer Stichprobengröße von 689 Partikeln mit 79,5 % beobachtet, während der Anteil bei zufälliger Einschließung 33,4 % betrug.

Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl die Einschlusswirkungsgrade für einzelne als auch für doppelte Partikel die Zufallswerte um mehr als den Faktor zwei übersteigen und die Anzahl der Tropfen, die nicht die gewünschte Anzahl an Zellen oder Partikeln enthalten, erheblich verringern. Die Bedeutung geeigneter Partikel- oder Zellkonzentrationen für einen hohen Einschlusswirkungsgrad wird in diesem experimentellen Durchlauf veranschaulicht. Während die Ölfeststoff- und wässrigen Durchflussraten dieselben sind wie im zuvor gezeigten Durchlauf zur doppelten Partikeleinschließung, ist die durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Tropfen (Lambda) auf 1,57 gesenkt worden.

Daher tritt keine vollständige Ordnung auf, wodurch Lücken in den Tröpfchenreihen entstehen und Sonnentropfen mit weniger als erwarteten Teilchen zurückbleiben. Dieses Histogramm zeigt die verringerte Effizienz der Einschließung von zwei Teilchen aufgrund des niedrigeren Lambda-Werts. Bei einer Stichprobengröße von 324 Tropfen betrug der durchschnittliche Anteil an Tropfen mit zwei Teilchen 55,9 %, wobei nahezu genauso viele Einzelteilchen-Tropfen wie Doppelteilchen-Tropfen vorhanden waren.

Dies bedeutet, dass Lambda gleich oder nahe der gewünschten Anzahl von Zellen pro Tropfen sein sollte, um die korrekt verkapselten Partikel oder Zellen zu maximieren, wobei der genaue Wert von Lambda abhängig davon gewählt wird, ob weniger oder mehr Zellen pro Tropfen akzeptabel sind. In dieser Demonstration nutzen wir Dichteunterschiede, um während des Experiments eine Echtzeit-Steuerung der Konzentration zu ermöglichen. Für länger dauernde Experimente kann es jedoch ratsam sein, die Dichten anzupassen, um nach der Verkapselung der Zellen in wässrige Tropfen konsistentere Ergebnisse zu erzielen.

Zeitabhängige Experimente können in einer Zentrifugenprobe oder unter einem Mikroskop durchgeführt werden, indem die Tropfen erneut in mikrofluidische Arrays injiziert werden.