Modeling Colitis-assoziierten Krebs mit Azoxymethan (AOM) und Dextransulfat Natrium (DSS)

Am Tag null injizierte Myer Azoxymethan oder ein OM in der folgenden Woche. Ihr Trinkwasser wird durch eine Lösung ersetzt, die Natrium-Dextran-Sulfat oder DSS enthält. In der dritten Woche erhalten die Mäuse zwei Wochen lang Wasser.

Dieser DSS-Wasserkreislauf wird zwei weitere Male wiederholt. Nach dem zweiten DSS-Zyklus können Mäuse mittels Spiegelung auf Tumore untersucht werden.

Nach Woche 10 werden die Mäuse getötet und die Kolons entnommen. Die Kolons werden gespült und längs eröffnet. Die Kolons werden auf Tumorgröße und Anzahl der Tumoren untersucht.

Ein Längsschnitt des Kolons in Dritteln kann eingebettet und zur histologischen Analyse eingereicht werden. Mit Hilfe der Lichtmikroskopie können Tumore gezählt und klassifiziert werden. Wir demonstrieren ein Protokoll, bei dem die Verabreichung des genotoxischen Agents a OM gefolgt von drei Zyklen des proinflammatorischen Agents erfolgt.

DSS erzeugt rasch und reproduzierbar Kolontumoren bei Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten zu den beim Menschen im Rahmen einer colitisassoziierten Karzinogenese beobachteten Tumoren. Markieren Sie die einzelnen Mäuse am Tag null mit Schwanzmarkierungen oder Ohrkennzeichen, notieren Sie das Ausgangsgewicht jedes Tieres in einer Tabelle und injizieren Sie anschließend jedem Tier eine Lösung von 10 Milligramm pro Kilogramm eines OM-Trainings. Vorsicht beim Umgang mit OM, da es ein gentoxisches Agens ist. Am Tag sieben erhalten die Tiere eine mit 2,5 % DSS angereicherte Trinklösung für die folgende Woche. Zur Herstellung dieser Lösung wird DSS-Pulver in destilliertem Wasser gelöst und solange gerührt, bis es vollständig aufgelöst ist.

Die Lösung ist gebrauchsfertig, nachdem sie durch einen 0,2-Mikron-Celluloseacetat-Filter geführt wurde. Um eine kontinuierliche Versorgung mit DSS-Lösung über sieben Tage sicherzustellen, sollte die DSS-Lösung alle zwei bis drei Tage erneuert werden.

Nach dieser Zeit wechseln Sie die Käfige für zwei Wochen zurück auf Wasser. Wiegen Sie die Mäuse zwei- bis dreimal pro Woche und beobachten Sie auf rektale Blutungen und Durchfall. Mäuse mit großen Tumoren können vorübergehend einen rektalen Prolaps entwickeln, dies reduziert jedoch im Allgemeinen nicht die Überlebensrate.

Der Gewichtsverlust relativ zur Ausgangsbasis wird als Surrogatmaß für die Schwere der Kolitis verwendet. Ein Gewichtsverlust von bis zu 10 %, verbunden mit zwei bis drei Tagen Durchfall und rektalem Blutungen, ist in der Woche nach einem vollständigen DSS-Endoskopiezyklus zu erwarten. Nach dem zweiten oder dritten DSS-Zyklus kann eine Bestätigung des Tumorwachstums in vivo vor der Tötung erfolgen.

Da das A-O-M-D-S-S-Modell sehr zuverlässig Tumoren erzeugt, ist dieser Schritt im Allgemeinen nicht erforderlich. Nur wenige Mäuse sollten mit dieser Methode untersucht werden, da sie das Potenzial hat, die Tumore der Mäuse zu stören. Ihr Arbeitsbereich sollte einen Becher mit steriler, gepufferter Phosphatlösung oder PBS sowie einen leeren Becher umfassen.

Um verbrauchtes PBS zu entsorgen, acht bis 10 Milliliter PBS in eine Spritze aufziehen und pro Anwendung am Endoskop anschließen. Um intraluminale Inhalte zu spülen, jedes Maus mit inhalativer oder injizierbarer Sedierung anästhesieren und die Maus mit Klebeband am Schwanz und an der Brust auf einer flachen Unterlage fixieren; die Fußpolster der Maus können fixiert werden. Um eine ausreichende Sedierung sicherzustellen, mit Daumen und Zeigefinger den Unterbauch der Maus anfassen, um den Anus freizulegen, und das Muren-Endoskop in das Rektum der Maus einführen.

Vorsichtig mit PBS aufblasen und spülen, um die intraluminale Sicht zu verbessern und fäkale Inhalte zu entfernen. Setzen Sie die langsame Vorschubbewegung des Endoskops unter Beobachtung des Monitors fort. Am Tag 70 sollte jede mit A-O-M-D-S-S behandelte Maus aufgrund makroskopisch sichtbarer Tumoren mehrere Kolontumoren aufweisen und zur Beurteilung bereitstehen.

Dieser Zustand kann um Wochen bis Monate verzögert werden, wenn größere Tumore gewünscht sind. Bereiten Sie eine mit PBS gefüllte Spritze vor, die an eine Magensonde angeschlossen ist. Eine mit 10 % Formalin beladene Spritze, chirurgische Schere, Schere mit abgerundeten Spitzen.

Eine kleine Spritze, gefüllt mit 1 % Ian-Blau-Lösung, und eine feine Pinzette. Legen Sie außerdem ein kaltes Tablett, ein Wegfahrschiffchen mit gekühlter PBSA, ein neues Rasiermesser zum Schneiden und ein Fixierbecken mit 10 % Formalin bereit. Töten Sie jede Maus durch Isofluran und cervikale Dislokation oder eine andere institutionell genehmigte Methode. Endgewicht und andere Messungen können anschließend vorgenommen werden.

Zu diesem Zeitpunkt legen Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben auf ein Schneidebrett. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70 %igem Ethanol ab, um die Haare vom Präparationsbereich fernzuhalten. Greifen Sie mit einer Pinzette die Bauchmitte und führen Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut, um das Peritoneum freizulegen.

Verwenden Sie sanfte Zugkraft, um die Haut vom Peritoneum zu lösen, und legen Sie die gesamte Bauchhöhle frei. Führen Sie einen Schnitt in das Peritoneum ein und verlängern Sie diesen Schnitt beidseitig entlang des Rippenbogens. Benutzen Sie geschlossene Scheren, um Dünndarm und Dickdarm zur Seite zu schieben.

Dadurch werden die mesenterialen Lymphknoten freigelegt, die optional gewonnen werden können. Zur Beurteilung den urogenitalen Trakt kaudal verlagern, um den Colon descendens und das Rektum freizulegen; die Harnblase und die Fortpflanzungsorgane gegebenenfalls entfernen, um das Becken weiter freizulegen, wobei darauf geachtet werden muss, angrenzende Gewebe nicht zu verletzen.

Schneiden Sie durch die untere und obere Schambeinwulst, um die anorektale Verbindung freizulegen. Schneiden Sie die Haut um die anorektale Verbindung herum, um den Colon zu lösen, während Sie sanft nach oben gerichtete Zugkraft ausüben. Mit mesenterischen Pinzetten können die mesenterischen Verbindungen des Colons abgetrennt oder vorsichtig gelöst werden.

Es ist wichtig, etwas Haut an der anorektalen Übergangszone beizubehalten, da dieser Bereich häufig von einer Dysplasie betroffen ist. Durchtrennen Sie das große vom kleinen Darm unmittelbar proximal zum Zäkum. Lösen Sie das Zäkum vom angrenzenden Colon mit einer mit einer 18-Gauge-Gavagekanüle versehenen Fünf-Milliliter-Spritze.

Spülen Sie den Dickdarm mit eiskalter PBS, sodass die Flüssigkeit in physiologischer Richtung austritt, unter Verwendung einer Schere mit abgerundeten Kanten. Öffnen Sie den Dickdarm entlang des Mesenteriums. Legen Sie den geöffneten Dickdarm auf das kalte Tablett.

Stellen Sie sicher, dass das Tablett ausreichend aufgetaut ist, um das Gewebe nicht einzufrieren. Geben Sie mit dem Finger einige Tropfen 1 % Ian Blue auf, um Tumore besser sichtbar zu machen. Bestimmen Sie die Anzahl und Größe der Tumore mit einem Lineal oder fertigen Sie Fotografien für eine digitale Analyse an.

Kleine Tumorabschnitte im angrenzenden Normalgewebe können an dieser Stelle für zukünftige Analysen mittels RNA-, Protein- oder immunhistochemischer Methoden entfernt werden, wobei ein Teil des Kolons für die histologische Beurteilung zurückbleibt. Geben Sie 10 % Formalin mit einer Spritze oder dem Finger in den verbleibenden Kolonabschnitt auf dem kalten Tablett, und lassen Sie das Gewebe mindestens 30 Sekunden lang fixieren. Auf diese Weise wird die Übertragung in das Fixierbecken erleichtert.

Stellen Sie sicher, dass vor dem Anbringen eines neuen geöffneten Kolons auf demselben Tablett restliches Formalin abgewischt wird. Überführen Sie den Kolon in ein Becken, das mit 10 % Formalin gefüllt ist, und fixieren Sie ihn an den Rändern. Nach dreistündiger Fixierung entsorgen Sie das Formalin und ersetzen es durch 70 % Ethanol.

Das Colon kann unbegrenzt in 70 % Ethanol konserviert werden. Unter Verwendung von geringer Wärmezufuhr eine Lösung mit 2 % Agar herstellen und einen sauberen Objektträger auf einer Glasplatte bereitstellen. Das fixierte Colon in drei Teile schneiden und ungenutzte Stücke in das Ethanolbad zurückgeben.

Reduzieren Sie die Schnitte auf eine einheitliche Größe mithilfe von zwei Rasierklingen. Legen Sie die Kolonschnitte und -schichten in Agar auf dem sauberen Objektträger ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das nächste Kolon.

Schnittansicht, überschüssiges Agar entfernen und den eingebetteten Colon in ein Kästchen zur Verarbeitung und Färbung mit Hämatin und Eosin geben. Abbildung eins zeigt den Ablauf für die Induktion von kolitisassoziiertem Karzinom. Abbildung zwei zeigt das Mausgewicht im Verhältnis zum Ausgangswert während der Verabreichung von OM und DSS.

Beachten Sie, dass die Mäuse in der Woche nach jedem DSS-Zyklus fünf bis zehn Prozent ihres Körpergewichts verlieren. Der Gewichtsverlust in diesem Experiment ist ein Surrogatmarker für die Schwere der Kolitis. Abbildung drei zeigt eine Ansicht von Tumoren im distalen Kolon mittels muriner Endoskopie am Tag 50 der A-O-M-D-S-S-Behandlung.

Beachten Sie die mehrfachen polypösen Massen, die das Lumen des distalen Kolons in den Abbildungen B und C im Vergleich zum normalen Kolon verlegen. In Abbildung A zeigt Abbildung vier ein longitudinal geöffnetes Mauskolon, das das makroskopische Erscheinungsbild von Tumoren veranschaulicht. Beachten Sie die höhere Tumormasse im distalen Kolon und die charakteristische ated-Textur des proximalen Kolons mit geringem Tumorwachstum.

Abbildung fünf zeigt Tumore, die durch die Anwendung von Lc und Blaufärbung hervorgehoben werden. Beachten Sie, wie die Färbung die normale Textur des Kolons sowie die Grenzen jedes einzelnen Tumors betont. Eine solche Färbung kann bei der genauen Messung der Tumorflächen mit dem Lineal oder mittels digitaler Messung hilfreich sein.

Abbildung sechs zeigt die repräsentative Verteilung der durchschnittlichen Anzahl von Tumoren pro Maus, die mit OM und DSS behandelt wurde. Beachten Sie, dass die Mehrheit der Tumoren im distalen Kolon lokalisiert ist und einen Durchmesser von weniger als zwei Millimetern aufweist. Abbildung sieben zeigt paraffin-eingebettete Längsschnitte des Kolons in einer Kassette sowie einen H-und-E-gefärbten Objektträger.

Beachten Sie, dass Reste von S und blauer Färbung die H- und E-Färbung nicht stören. Auf dem Bild des Objektträgers ist ein großer Tumor umkreist. Die Bezeichnungen distal, mittel und proximal ergeben sich aus der Aufteilung des gesamten Kolons in Drittel zwischen Caecum und Anus.

Abbildung acht zeigt die repräsentative Histologie eines Tumors, der nach Gabe von OM und DSS im distalen Kolon entstanden ist. Die dargestellten Mikrofotos wurden mit H- und E-B-R-D-U sowie Beta-Catenin gefärbt und weisen dysplastische Veränderungen auf, die kolorektalen Adenokarzinomen des Menschen ähneln. In diesem Video haben wir ein Protokoll zur Entzündung-induzierten kolorektalen Tumorbildung bei Mäusen demonstriert, das eine einzige Injektion von OM gefolgt von drei siebentägigen Zyklen mit DSS umfasst.

Über einen Zeitraum von 10 Wochen induziert dieses Modell Tumoren mit histologischen und molekularen Veränderungen, die jenen im menschlichen kolitisassoziierten Karzinom eng ähneln, und stellt ein äußerst wertvolles Modell für die Untersuchung der Onkogenese und der chemoprophylaktischen Maßnahmen bei dieser Erkrankung dar.