Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren besteht darin, gereinigte Discs zu erzeugen. Eine aggregationsfähige Form, die in der Lage ist, Wirtszellen zu infizieren. Zwei verschiedene Methoden, um dieses Ziel zu erreichen, werden mit der ersten Methode demonstriert.

Das asomale bildende fluoreszierende Protein-Disc-Eins-Fusionsprotein wird in NLF-menschlichen Neuroblastom-Donorzellen überexprimiert. Die Zellen werden anschließend mit PBS gewaschen, gesammelt und ohne Verwendung von Detergenzien lysiert. Die DNA wird digeriert und Agro-Zonen mittels eines Zuckergehaltsystems gereinigt.

Agrios, die mit dieser Methode gereinigt wurden, weisen eine geringe Zellinvasions-Effizienz auf. Der alternative Ansatz besteht darin, die Aminosäuren 5 98 bis 7 85 des rekombinanten Disc-one-Proteins in E. coli überzuexprimieren. Das Proteinfragment wird anschließend mit DITE 5 94 markiert, dialysiert und mittels einer NI-NTA-Matrix gereinigt, wodurch alle verbleibenden ungebundenen Farbstoffe und multimeren Disc entfernt werden.

Mit dieser Methode erzeugte One-Fragmente weisen eine hohe Zellinvasions-Effizienz zur Beurteilung der Wirtszellinvasion auf. Entweder die gereinigte fluoreszierende Proteinscheibe, One-Risome oder die markierte rekombinante Scheibe. Die One-Fragmente werden mit den gewünschten Empfängerzellen inkubiert.

Trian-Blau wird anschließend hinzugefügt, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu unterdrücken, und die Invasion wird mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Bisher wurde die Proteinausscheidung nicht als Merkmal chronischer psychischer Erkrankungen wie der Schizophrenie anerkannt. Wo das bei Schizophrenie gestörte Protein 1 ein Kandidat für die Zellinvasivität ist, stellt die Bildung von Proteinaggregaten ein kennzeichnendes Merkmal für Proteinkonformationskrankheiten dar.

Hier zeigen wir mit zwei Methoden, dass Disc-One-Proteinaggregate zellinvasiv sind, und folglich, dass Disc-One-assoziierte Erkrankungen oder Disc-One-Neuropathien konformationelle Proteinopathien sind. Die beiden Methoden sind erstens die Reinigung des vollständigen Disc-One-ASOS aus Neuroblastomzelllinien und zweitens die Expression eines C-terminalen multimeren Disc-One-Fragments in E. coli sowie die Reinigung und Markierung mit dem fluoreszierenden Farbstoff.

Während die erste Methode nur zu einer geringen Effizienz bei der Zellinvasion führt – lediglich 0,3 % der Zellen nehmen die gereinigten Mikrosomen auf – infiziert das gereinigte rekombinante Proteinfragment bis zu 20 % der exponierten Zellen. Die hier beschriebenen Methoden sollten auf andere Proteine übertragbar sein, bei denen die Akrosombildung oder multimerische Assemblierung überzeugend nachgewiesen wurde. In jedem der 10 10-Zentimeter-Dishs.

Säen Sie 1,5 × 10⁶ humane Neuroblastom- und LF-Zellen in supplementiertem RPMI 1640-Medium und kultivieren Sie sie über Nacht. Am nächsten Tag sollten die Zellen 70 bis 80 % konfluent sein. Beschriften Sie fünf Petrischalen für die Transfektion mit PCDNA3.1-mRFP und EGFP-markiertem humanen vollständigen DISC1 sowie fünf weitere für die Transfektion mit dem alleinigen EGFP-Plasmid. Kombinieren Sie für jede 10 cm-Schale 15 µg Plasmid-DNA, 30 µl Metafecting und 750 µl.

Opti MEM in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufnehmen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lösen, 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die DNA-Transfektionsreagenzlösung tropfenweise zu den Zellen geben, um diese zu transfizieren, und die Zellen 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO₂ inkubieren. Danach die Expression von mRFP, vollständige Länge, Disc1, überwachen und die Bildung von Agro-Zonen mittels Fluoreszenzmikroskopie bestätigen. Einige Zellen weisen massive Einschlüsse des fluoreszierenden Proteins auf, wie hier gezeigt.

Dieses Protokoll kombiniert eine Methode zur Reinigung von Lewy-Körperchen aus Gehirngewebe mit dem Protokoll zur Isolierung größerer Aggregate oder Agrozonen, da bereits bestehende Methoden auf der Verwendung von Detergenzien basieren und die Isolierung detergentienfreier Proteine für die Anwendung in Zellinvasivitätsassays entscheidend ist. Danach das Medium abpipettieren, mit PBS waschen und 400 Mikroliter PBS mit Proteaseinhibitorcocktail hinzufügen. Anschließend die Zellen abkratzen und ein Milliliter Zellsuspension sowie 10 Keramikkügelchen in ein zwei Milliliter fassendes Lysetrögelchen geben.

Lysieren Sie die Zellen mit drei 62. Impulsen auf einem Vor-Zelllyse-24-Homogenisator. Die mechanische Kraft des Prozesses kann die Temperatur in der Probe über 37 Grad Celsius ansteigen lassen. Daher sollte darauf geachtet werden, die Probe nach dem Lysevorgang auf Eis abzukühlen. Nach dem Abkühlen der Zellen auf Eis 10 Millimolar Magnesiumchlorid und 40 Einheiten pro Milliliter DNAA hinzufügen und 60 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren.

Stellen Sie jeweils 10 Milliliter 80 %, 50 % und 20 %iger Saccharoselösung bezogen auf das Volumen in PBS her. Bereiten Sie dann in einem 15-Milliliter-Konischgefäß den Saccharosegradienten vor, indem Sie mit zwei Millilitern 80 %iger Saccharoselösung beginnen, gefolgt von zwei Millilitern 50 %iger und zwei Millilitern 20 %iger Saccharoselösung. Gießen Sie den Gradienten langsam ein und achten Sie darauf, die bereits eingefüllten Schichten nicht zu stören.

Schichten Sie anschließend das verdauten Lysat auf der Gradientenoberfläche auf und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 1000 × g und vier Grad Celsius. Sammeln Sie vorsichtig die Grenzfläche zwischen der 50- und 80-%-Saccharoselösung mit einer Pipette und mischen Sie sie mit dem Fünffachen an Volumen in einem 15-Milliliter-Konizentrifugenröhrchen; zentrifugieren Sie erneut 15 Minuten bei 1000 × g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und bewahren Sie das Pellet, das die Agri-Zone enthält.

Wiederholen Sie die Waschung an dieser Grenzfläche zwei weitere Male. Agri-Zonen sind fluoreszierend und können nach der letzten Waschung im Mikroskop unter UV-Licht sichtbar gemacht werden; verwerfen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 250 bis 500 Mikrolitern PBS. Dieses Pellet enthält die gereinigten Agro-Zonen.

Gebe 10 µL MRFP-Disc, eine Asom-Suspension, in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte mit SHSY5Y-Human-Neuroblastomzellen. Diese exprimieren konstitutiv lösliches GFP-Disc am C-Terminus auf sterilen Glas-Deckgläsern. Inkubiere 48 bis 72 Stunden. Nach der Inkubation wasche die Zellen dreimal mit PBS und unterdrücke die extrazelluläre Fluoreszenz mit 0,04 % Trypanblau für fünf Minuten.

Anschließend mit PBS waschen, um das Trypanblau zu entfernen. Danach die Schale auf Eis stellen und 10 Minuten lang 4 % PFA in PBS hinzufügen, um die Zellen zu fixieren. Danach einmal mit steriler Wasser waschen und die Deckgläser mit einem DPI-Mounting-Medium wie prolongiertem Gold auf Objektträgern montieren.

Bestätigen Sie die Aufnahme in die Invasion von exogenen Aggro-Zonen durch Kollokalisierung mit rekrutierten Proteinen, die von Empfängerzellen in Zack-Bildern exprimiert werden. Dieser Zack umfasst eine Tiefe von etwa sechs Mikrometern.

24 Aufnahmen in Schritten von 200 Nanometern. Die Fluoreszenz der MRFP-markierten Disk-Eins-agri-Zone, dargestellt in Rot, rekrutiert die zytoplasmatische GFPC-markierte Disk-Eins-Zone. Eine Überlagerung, dargestellt in Grün, erscheint gelb und zeigt an, dass die agri-Zonen in das Zytoplasma des Empfängers eingedrungen sind und das zuvor lösliche Disk-Eins-Protein rekrutiert haben.

In diesem Teil des Protokolls wird die humane Scheibe eins mit DITE 5 94 markiert. Dieses D ermöglicht die direkte Überwachung des rekombinanten Proteins, ohne dass eine zusätzliche Immunfärbung erforderlich ist. Beginnen Sie damit, das wie im begleitenden Dokument beschrieben hergestellte Protein durch dreimaliges Dialysieren in zwei Litern PBS bei einer Verdünnung von eins zu 2000 von Beta-Mercaptoethanol zu befreien.

Als Nächstes ein Milligramm Disc mit DITE 5 94 IDE beschriften, ein Milligramm pro Milliliter Protein in PBS lösen und fünf Millimolar TCEP hinzufügen, um freie TH-Gruppen zurückzugewinnen; 20 Mikroliter des in DMF gelösten Farbstoffs zur Reaktion hinzufügen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Mithilfe einer SLI-Dialysiskassette mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von 10.000 Dalton das Protein dreimal im Verhältnis 1:2000 in PBS dialysieren, jeweils zwei Stunden lang. Danach die Reinheit des markierten Proteins weiter erhöhen.

Eine Affinitätsreinigung basierend auf einem His-Tag an einer NI-NTA-Säule wird durchgeführt. Waschen Sie ein Milliliter NI-NTA-Matrix mit 10 Milliliter PBS, anschließend wird das markierte dialysierte Protein auf die Säule aufgetragen und durch die Säule laufen gelassen.

Langsam verliert die Lösung aufgrund der Bindung des Proteins an die NTA-Matrix einen Teil ihrer blauen Farbe; ungekoppelter Farbstoff bleibt im Durchlauf. Sobald die Proteiniösung vollständig aufgetragen ist, waschen Sie die Säule dreimal mit je 20 Milliliter PBS, um das Protein eluieren zu lassen, und geben Sie anschließend zwei Milliliter PBS mit 500 Millimolar Ole zur Säule hinzu.

Stellen Sie das Ventil auf langsame Geschwindigkeit ein und eluieren Sie tropfenweise, während Sie den farbigen Bandverlauf an der N NI NTA-Säule überwachen. Um das erwähnte farbige Fraktion des Eluats, das ein markiertes rekombinantes Protein enthält, abzutrennen, überführen Sie das EIT in eine SLI-Dialyseskassette und dialysieren das EIT dreimal gegen jeweils zwei Liter 10 Millimolar NAPI unter einer Verdünnung von 1 zu 2000, wobei jede Dialyse zwei Stunden dauert. Danach wird das EIT durch einen sterilen Spritzenvorfilter mit 0,45 Mikrometer Porengröße filtriert, in jeweils fünf Portionen zu je 100 Mikroliter aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Die Gesamtmenge an Protein sollte in jeder 100-Mikroliter-Aliquotprobe 0,5 bis ein Mikrogramm pro Milliliter betragen. Um die Invasivität des Proteins zu bewerten, Medium hinzufügen, das fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter markiertes rekombinantes Disc-One-Protein enthält, zu jedem Wells einer 24-Well-Platte mit auf sterilen Glasdeckgläsern kultivierten SH-SY-5Y-menschlichen Neuroblastomzellen, die konstitutiv das lösliche GFP-Tag am C-Terminus von Disc One exprimieren, und 48 bis 72 Stunden inkubieren.

Löschen Sie die extrazelluläre Fluoreszenz, fixieren und montieren Sie die Zellen wie bei den mit Agri-Zone behandelten Zellen. Bestätigen Sie die Invasion des exogen applizierten rekombinanten Proteins mittels Zack Imaging. Wenn das markierte Protein aufgenommen wird, ist es in den Bildern der konfokalen Mikroskopie innerhalb der Umrisse der empfangenden Zellen nachweisbar. Dieses Zack umfasst eine Tiefe von etwa fünf Mikrometern bei 24 Schritten zu je 220 Nanometern.

Hier wird das rekombinante Disc-eins-Fragment 598 bis 785, das in Rot dargestellt ist, von Empfängerzellen aufgenommen, die das lösliche, C-terminal mit GFP markierte Disc eins, in Grün dargestellt, exprimieren, um die Invasivität von Disc eins zu bestimmen. Agro-Zonen bestehend aus MRFP-markiertem vollständigem Disc-eins, wurden aus NLF-Zellen gereinigt und wie in diesem Foto gezeigt auf Empfänger-SH-SY-5Y-Zellen aufgetragen. Ein mit A-M-R-F-P markiertes Disc-eins-Akrosom drang in eine humane Neuroblastom-SH-SY-5Y-Zelle ein, die lösliches, mit GFP markiertes C-terminales Disc eins exprimierte.

Außerdem war das mit MRFP markierte Disc-eins-Asome in der Lage, lösliches, mit GFP markiertes Disc-eins in unlösliche Aggregate zu rekrutieren, um die Invasivität zu bestimmen. DIA-Licht-markiertes rekombinantes Disc-eins wurde auf SH-SY-5-Y-Neuroblastomzellen angewendet, die lösliches GFP-Disc-eins exprimieren, wie hier gezeigt. Das rekombinante Disc-eins-Protein, dargestellt in Rot, drang in die Empfängerzelle ein; gelbe Punkte zeigen eine Rekrutierung des löslichen, mit GFP markierten C-terminalen Disc-eins in Aggregate an. Das rekombinante Disc-eins, exprimiert und aus E. coli gereinigt, zeigte sich ebenfalls in vivo als zellinvasiv für Neuronen, als das multimerische Protein stereotaktisch in den medialen präfrontalen Kortex einer Ratte injiziert wurde. Zack-Bildgebung bestätigt das Vorhandensein des rekombinanten Disc-eins-Proteins in kortikalen Rattenneuronen, die mit einem Antikörper gegen neuronale Kerne gefärbt wurden.

Wir haben Ihnen soeben zwei Methoden zur Erzeugung von Disc-eins-Aggregaten zur Untersuchung der Zellinvasion gezeigt. Mit Hilfe dieser Methoden können wir die zellulären Effekte der Aufnahme von Disc-eins-Aggregaten untersuchen, ohne die möglicherweise störenden Variablen der rekombinanten Genexpression durch Transfektion mit fremder DNA. Diese Techniken lassen sich anwenden, um die biologischen Effekte der Disc-eins-Proteinpathologie in vitro in Zellen sowie in vivo durch intrazerebrale Inokulation oder andere Applikationsweisen in Tiermodellen zu erforschen.

Wir sind zuversichtlich, dass sich diese Methoden letztendlich mit geringen Anpassungen des für jedes spezifische Protein übernommenen Protokolls auch auf andere Proteinaggregate übertragen lassen. Achten Sie darauf, ausreichend Zeit für die sorgfältige Analyse der konfokalen Mikroskopiebilder einzuplanen, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.