A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Migration von adulten, abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen in Gegenwart eines Gleichstrom-Elektrikfelds sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst subependymale neuronale Vorläuferzellen aus der erwachsenen Maus isoliert und kultiviert werden. Der nächste Schritt besteht darin, Galvan Axxis-Kammern vorzubereiten und die neuronalen Vorläuferzellen auf die Kammern zu übertragen.

Der letzte Schritt besteht darin, ein elektrisches Gleichfeld über die Galvan Axxis-Kammer anzulegen und eine Zeitrafferaufnahme durchzuführen, um die Migration der neuronalen Vorläuferzellen zu beobachten. Letztendlich erfasst die Zeitraffermikroskopie die galvanotaktischen Eigenschaften neuronaler Vorläuferzellen in ihrem differenzierten und undifferenzierten Zustand. Obwohl diese Methode Einblicke in die Galvanotaxis neuronaler Vorläuferzellen ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf ein Maus-Modell eines Schlaganfalls zur Rekrutierung neuronaler Vorläuferzellen an Läsionsstellen, um die neuronale Reparatur zu fördern.

Den Ablauf wird Rob Pilley, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Zum Beginn dieses Verfahrens müssen die NPCs sieben Tage lang in Kultur gewesen sein, damit freischwimmende primäre Neurosphären zur Gewinnung bereitstehen. Falls erforderlich, bereiten Sie drei Galvan-Axxis-Kammern vor, indem Sie drei quadratische Glasplättchen platzieren.

Nummer eins, Deckgläser über Nacht in eine Flasche mit sechs normaler Salzsäure geben. Am nächsten Tag früh den Matra-Gel langsam auf Eis auftauen lassen. Nach vier Stunden ist er gebrauchsfertig, um die Kammer zu bauen.

Verwenden Sie zunächst eine Glasschneidplatte mit Diamantspitze, um sechs rechteckige Streifen aus neuen quadratischen Deckgläsern zu schneiden. Überführen Sie die mit Säure gewaschenen quadratischen und rechteckigen Deckgläser in eine laminare Luftströmungshaube.

Spülen Sie die Glasstreifen mit 70 % Ethanol und anschließend mit steriler, zellkulturgeeigneter Wasser, das durch Autoklavieren sterilisiert wurde. Lassen Sie sie an der Luft trocknen oder trocknen Sie sie auf fusselfreiem Papier. Tragen Sie danach Vakuumfett auf den Rand einer Oberfläche jedes quadratischen Objektträgers auf und verschließen Sie sie an der Basis von 60 Millimeter großen Kunststoffschalen.

Petri-Schalen. Vakuumfett auf eine Seite der rechteckigen Glasstäbe auftragen und diese an gegenüberliegenden Kanten der quadratischen Objektträger befestigen, um Quadrate mit einer zentralen Rille in der Mitte jeder Schale zu erzeugen.

UV-sterilisieren Sie diese modifizierten Glasscheiben oder -kammern mindestens 15 Minuten lang in einer Sterilbox. Danach pipettieren Sie 250 bis 300 Mikroliter Poly-L-Lysin in die zentrale Vertiefung der Kammern. Anschließend inkubieren Sie die Kammern zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, etwa 15 Minuten vor Ende der Inkubation.

Bereiten Sie die Matri-Gel-Lösung nach zwei Stunden vor, saugen Sie das Polyol-Lysin ab und waschen Sie die mittleren Rillen mit einem Milliliter autoklaviertem Wasser. Danach pipettieren Sie 250 bis 300 Mikroliter Matri-Gel-Lösung auf die mittleren Rillen und inkubieren Sie die Kammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation saugen Sie die Matrigel-Lösung ab.

Spülen Sie dann die zentralen Rillen vorsichtig mit ein bis zwei Milliliter SFM aus. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter E-F-H-S-F-M oder F-B-S-S-F-M auf die zentralen Rillen, um die kultivierten Zellen vorzubereiten. Danach pipettieren Sie vier bis fünf Milliliter der Neurosphären enthaltenden Kultur in eine neue 60 Millimeter große Petrischale.

Danach die Petrischale auf den Objekttisch des Zählmikroskops unter dem 5×-Betrachtungsobjektiv stellen. Mit einer P-10-Pipette vorsichtig fünf bis acht ganze Neurosphären in die zentrale Rille jedes Kammerabschnitts überführen. Bis zu vier.

Neurosphären können sofort übertragen werden, dürfen jedoch nicht zusammen mit den Neurosphären in den zentralen Rillen dissociiert werden. Vorsichtig verteilen, ohne das Matrigel-Substrat zu stören. Anschließend weitere 150 Mikroliter E-F-H-S-F-M oder F-B-S-S-F-M auf die zentralen Rillen geben.

Kultivieren Sie die Zellen nun in einem befeuchteten Inkubator. Nach 17 bis 20 Stunden in der Kultur stehen undifferenzierte NPCs nach 69 bis 72 Stunden zur Verfügung. In der Kultur sind differenzierte NPCs verfügbar.

Unter dem Rechnungsmikroskop die Kammer mit den besten Zellen für die Live-Zell-Bildgebung zur Migrationsanalyse auswählen. Die Zellen sollten rund sein, nahezu vollständig von ihren Neurosphären dissociiert und noch keine oder erst ansatzweise Ausläufer im Haubenraum gebildet haben. Einen Kammerdeckel vorbereiten.

Spülen Sie eine quadratische Glasdecke mit 70 %igem Ethanol und anschließend mit autoklaviertem Wasser, und tragen Sie einen Streifen Vakuumfett auf zwei parallele Kanten auf. Bedecken Sie nun die Kammer. Aspirieren Sie zuerst das Kulturmedium aus der zentralen Rille und verschließen Sie dann schnell die Decke, indem Sie die Decke wie ein Dach auf die rechteckigen Wände aufsetzen.

Als Nächstes 100 µL frisches Medium mithilfe der Kapillarwirkung in die zentrale Rinne einfüllen. Nun Vakuumfett verwenden, um Begrenzungen für die Kulturmedien-Pools zu schaffen. An beiden Enden der zentralen Rinne des Live-Cell-Imaging-Systems jeweils Agarose-Gel-Röhrchen, Silber-, Silberchlorid-Elektroden und zwei 60-mm-Petri-Schalen bereitstellen.

Als Reservoirs für das Kulturmedium lassen Sie die Kammer 20 bis 30 Minuten lang in einer Umgebung mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ruhen. Bereiten Sie währenddessen die Deckel der beiden leeren Petrischalen sowie den Deckel der Petrischale mit den Galvan Axxis-Kammern vor, indem Sie mit einem Dremel oder einer Pipettenspitze Löcher hineinbohren, 1,5 bis zwei Milliliter Medium auf jede Seite der zentralen Rille geben und je sieben bis acht Milliliter SFM in jede leere Petrischale füllen. Stellen Sie eine Petrischale auf jede Seite der zentralen Rille der Kammer und platzieren Sie eine Elektrode in jede Schale.

Verbinden Sie die Kammer mit den Petrischalen, um die elektrische Kontinuität herzustellen. Verbinden Sie mit Hilfe der Agaros-Gel-Brücken die Elektroden über ein in Reihe geschaltetes M-Messgerät mit einer externen Stromversorgung, um den elektrischen Strom zu messen, und schalten Sie die Stromversorgung ein. Messen Sie die Stärke des elektrischen Feldes direkt über die zentrale Rinne mit einem Voltmeter.

Passen Sie die Ausgabe der Stromversorgung nach Bedarf an. Starten Sie nun das Zeitraffermodul am Bildgebungssystem. Wählen Sie in der Axio-Vision-Software die mehrdimensionale Aufnahme aus und klicken Sie auf „See“.

Wählen Sie für die Kanäle Kanal sechs aus und klicken Sie auf T für Zeitraffer. Stellen Sie im Einstellungsmenü die Zeitraffer-Intervalleinstellungen auf eine Minute ein und legen Sie die Dauer auf acht Stunden fest, bevor Sie die Zeitpunkte vor und nach dem Zeitpunkt auswählen. Klicken Sie nun auf Start und lassen Sie das Experiment für die gewünschte Zeitdauer laufen. Nach Abschluss des Assays fahren Sie mit der IHC-Analyse fort.

Die kinematische Analyse zeigte, dass undifferenzierte NPCs in Gegenwart eines 250 Millivolt pro Millimeter betragenden DCEF hochgradig gerichtete und schnelle galvanotaktische Bewegungen in Richtung der Kathode aufweisen; bei dieser Feldstärke migrierten mehr als 98 % der undifferenzierten NPCs während der gesamten sechs bis acht Stunden, für die sie aufgezeichnet wurden. In Abwesenheit eines DCEF wurde eine zufällige Zellbewegung beobachtet.

Da tote Zellen nicht migrieren, deutet dies darauf hin, dass sie während dieses Zeitraums lebensfähig bleiben. In Abwesenheit oder Anwesenheit von A-D-C-E-F zeigten differenzierte Phänotypen eine vernachlässigbare Migration, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von A-D-C-E-F-Teilmengen differenzierter Zellen. Ausgedehnte Fortsätze, die dazu neigten, senkrecht zur Richtung des DCEF ausgerichtet zu sein, wiesen jedoch keine bemerkenswerte Translokation des Zellkörpers auf.

Die Immunfärbung bestätigte, dass NPCs nach sechs Stunden DC-ES-Belastung weiterhin positiv für den neuralen Vorläufermarker Nestin exprimierten. In den Assays mit NPCs, die zur Differenzierung in reife Phänotypen induziert wurden, exprimierte die Mehrheit der Zellen nach sechs Stunden DCEF-Belastung den Marker für reife Astrozyten, das gliale fibrilläre saure Protein oder GFAP. Nach Durchführung dieses Verfahrens können Einblicke in die zellulären Mechanismen gewonnen werden, die an der Umwandlung des Gleichstrom-Elektrikfelds in Zellmotilität beteiligt sind, unter Verwendung genetischer Knockout-Modelle.

Oder Sir, ein Beispiel hierfür.