Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein dorsales Neuralrohr-Explantat aus einem Wachtel-Embryo in einen altersentsprechenden Hühner-Embryo zu verpflanzen, um die Migration und das Schicksal der Neuralleistenzellen verfolgen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst ein kleines Loch in die IGN-Membran des Wirtsembryos aus Huhn gerissen wird, um Zugang zum Neuralrohr zu erhalten. Danach wird der spendende Wachtel-Embryo aus seinem Ei entfernt, um ihn für die Entnahme des Transplantats vorzubereiten.

Im nächsten Schritt wird der Bereich von Interesse aus dem Neuralrohr des Wirts-Embryos ausgeschnitten. Ein ähnlicher Bereich wird anschließend aus dem Neuralrohr des Spenders für die Transplantation entfernt. Danach wird das Neuralrohr des Spenders in das Neuralrohr des Wirts transplantiert.

Schließlich wird das chimäre Embryo bis zum gewünschten Entwicklungsstadium inkubiert, um ankommende Neuralleistenzellen im jeweiligen Organ nachzuweisen. Letztendlich kann die Migration und Differenzierung von Spender-abstammenden Neuralleistenzellen an verschiedene Orte im Wirts-Embryo mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Mikrodissektion und Transplantation äußerst feine motorische Fähigkeiten erfordern und daher schwer zu erlernen sind.

Spülen Sie zunächst jeglichen Schmutz von den Hühnereiern mit lauwarmem Wasser ab. Legen Sie die Eier horizontal auf ein Tablett und markieren Sie die nach oben zeigenden Seiten mit einem Bleistift, um den Bereich zu kennzeichnen, in dem sich das Embryo lokalisiert. Für die X-ovo-Präparation von Donorembrionen inkubieren Sie die Wachtelbeine stumpfe Seite nach unten.

Nun legen Sie die Eier in einen befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius und schalten die Wackelfunktion ein. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, desinfizieren Sie die Oberseiten der Eier, indem Sie sie mit 70 %igem Ethanol besprühen und dieses anschließend rasch mit einem Kim-Tuch abwischen. Um eine Absorption durch die Eierschale zu vermeiden, stellen Sie jedes desinfizierte Ei auf einen separaten Eierhalter, ähnlich der hier gezeigten Petrischale, die mit gefalteten Kim-Tüchern ausgelegt ist. Anschließend tippen Sie mit sterilisierten AA-Pinzetten ein kleines Loch in die obere Oberfläche der Eierschale am spitzen Ende des Eis.

Befestigen Sie eine Spritze mit einem Volumen von fünf Milliliter mit einer Kanüle der Größe 18,5. Führen Sie die Kanüle dann mit der Schräge in Richtung der spitzen Eiende vertikal in das Loch in der Eierschale ein. Um eine versehentliche Beschädigung des Eigelbs durch Saugwirkung zu vermeiden, reinigen Sie das Loch wie zuvor mit 70 %igem Ethanol und verschließen Sie es mit Klebeband.

Dann mit der Doppelpinzette ein weiteres Loch in die markierte obere Fläche des horizontalen Beins einbringen, jedoch nicht ganz an der Spitze. Anschließend eine Seite der gebogenen Iris-Pinzette parallel zum Ei in das Loch einführen. Danach mit der Pinzette auf der Schale zusammendrücken und in kreisförmigen Bewegungen weiterarbeiten.

Schlagen Sie ein zwei Zentimeter durchmessendes Fenster in die Eierschale des Hühnereis und entsorgen Sie das entfernte Eierschalenstück. Das Embryo sollte als undurchsichtige Scheibe auf der Oberseite des Eigelbs sichtbar sein. Entsorgen Sie alle unbefruchteten Eier, die sich durch einen kleinen weißen Fleck auf der Oberfläche des Eigelbs oder das Fehlen des Keimbläschens erkennen lassen.

Tragen Sie nun, unter Verwendung geeigneter Augenschutzmittel, eine 26½-Gauge-Hypodermikanadel und biegen Sie sie in einem Winkel von 45 Grad ausgehend von der Nadelspitze. Bringen Sie die gebogene Nadel mit der Schräge nach oben an einer Ein-Milliliter-Spritze an und füllen Sie die Nadel mit verdünnter Tusche. Durchstoßen Sie die Dottermembran außerhalb des Umfangs des Keimbläschens und schieben Sie die Nadelspitze unter den Embryo, dicht an der Oberfläche des Dotters, jedoch nicht in die embryonalen Schichten hinein.

Danach gerade genug Tinte injizieren, um den Embryo abzuzeichnen, und dabei vermeiden, dass Luftblasen eingespritzt werden. Die Nadel vorsichtig zurückziehen. Nun unter Verwendung eines Stereomikroskops und einer Lichtquelle mit geringer Wärmelast, wie der hier gezeigten faseroptischen Schwanenhalslampe.

Stufen Sie die Embryonen gemäß Hamburger und Hamilton ein. Notieren Sie die Entwicklungsstufe auf den Eierschalen. Geben Sie anschließend zwei bis drei Tropfen warme, sterile Ringer-Lösung auf die Oberfläche der Embryonen, um Austrocknung und Kontamination zu verhindern.

Streifen Sie dann Parafilm über die Oberfläche der Eier, um die Fenster vorübergehend abzudichten. Bereiten Sie anschließend die Wachtel-Eier für die Transplantation vor. Füllen Sie vor dem Entnehmen der Eier aus dem Inkubator eine Petrischale mit Ringer-Lösung.

Öffnen Sie dann die Eier an der stumpfen Seite mit einer gebogenen Pinzette, um das Embryo freizulegen. Verwenden Sie eine Präzisionsschere, um vier Schnitte in Form eines Quadrats durch die Zottenmembran und das äußere Keimblatt außerhalb des Embryos zu führen, wobei sichergestellt werden muss, dass alle Schnitte miteinander verbunden sind. Greifen Sie anschließend mit einer gebogenen Iris-Pinzette vorsichtig eine der Schnittkanten, heben Sie das Embryo aus dem Ei und überführen Sie es in die vorbereitete Petrischale.

Entfernen Sie abschließend vorsichtig die Vitellinmembran mit Pinzette Nummer fünf und bestimmen Sie anschließend das Entwicklungsstadium der Embryonen unter einem Stereomikroskop. Entfernen Sie die Parafolie vom Wirtshühnerembryo. Erzeugen Sie dann mit einer geschärften Wolframenadel ein kleines Loch in der Membran VII im gewünschten Bereich des Neuralrohrs.

Geben Sie einen Tropfen Ringer-Lösung zum Embryo hinzu. Führen Sie anschließend für einseitige Transplantate, wie sie in diesem Video durchgeführt werden, mit einer gezogenen Glasnadel vorsichtig transversale, rostrale und kaudale Einschnitte im Mittelhirnbereich des Neuralrohrs aus, ohne dabei das Lumen zu überschreiten. Schneiden Sie dann beidseitig zwischen dem dorsalen Neuralrohr und dem parietalen Mesoderm.

Entfernen Sie schließlich vorsichtig das ausgeschnittene Explantat vom Neuralrohr und nehmen Sie es dann durch Aspiration in eine Glas-Mikropipette auf. Verwenden Sie zunächst ein stadiengleiches Wachtel-Embryo. Schneiden Sie danach einen ähnlich großen Bereich des Neuralrohrs aus, wie gerade gezeigt, und aspirieren Sie das donorale Explantat in eine Glas-Mikropipette, die Ringer-Lösung enthält.

Übertragen Sie das X-Explant neben die ausgeschnittene Region des Hühnerwirts. Richten Sie dann mit einer gezogenen Glasnadel das Explant vorsichtig in die ablatierte Region ein. Geben Sie vorsichtig einige Tropfen Ringer-Lösung zum Embryo, um Austrocknung zu verhindern.

Schließlich das Fenster mit Packband versiegeln, wobei sichergestellt werden muss, dass das Band den gesamten Bereich des fensterierten Eies abdichtet, und das Ei bis zum gewünschten Entwicklungsstadium in den Inkubator zurückstellen, wobei die Schwenkfunktion während der Inkubation der Kyira ausgeschaltet bleibt; das X kann zweimal täglich vorsichtig von Hand gedreht werden, um die Lebensfähigkeit zu erhöhen. Falls spätere Entwicklungsstadien angestrebt werden, zeigt dieses repräsentative Bild der transplantierten Region des Neuralrohrs nach sechs Stunden erneuter Inkubation bis zum HH-Stadium 11 die erwartete Integration des transplantierten Wachteldonor-Gewebes in das Neuralrohr des Wirtshühnchens. Dieser Querschnitt durch die transplantierte Region im HH-Stadium 11 zeigt Neurocristazellen, die mit hnk markiert sind, wobei eine seitlich vom Neuralrohr wegwandert.

Quailazellen, die zum migrierenden Neuralleistenzellstrom und zum Neuralrohr beitragen, sind deutlich mit QCPN markiert. In späteren Entwicklungsstadien können aus Qualleneuralleistenzellen hervorgegangene Zellen bis zu ihrem endgültigen Zielgewebe verfolgt werden. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, sind QCPN-markierte Zellen im Mesenchym des maxillären Fortsatzes des Hühnerembryos verstreut. Bei Embryo 5 (E5) kann der QCPN-Antikörper leicht mit anderen Antikörpern kombiniert werden, um die Differenzierung quallenderivierter Neuralleistenzellen zu untersuchen.

Im Wirtsmilieu. Wie hier zu sehen ist, werden aus Zellen des Neuralwalls der Wachtel hervorgegangene trigeminale sensible Neuronen durch die Antikörper QCPN und T UJ markiert. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Gewebe aus Neuralwandzellen entstehen und welche Gene Neuralwandzellen exprimieren, während sie sich in verschiedene Gewebe differenzieren.