Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation
15. Mai 2012
Ein Gerät mit Chemikalien werden beschrieben, um sequentiell Isolierung von Nukleinsäuren durch Proteine aus einer Probe ohne Einsatz von Elektrizität an. Das Werkzeug besteht aus einem Sorptionsmittel innerhalb einer Transferpipette gehalten, während die Isolation Chemie auf Festphasenextraktion Prinzipien beruhen. Die isolierten Makromoleküle durch Immun-basierten und PCR-basierten Assays analysiert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, PCR-fertige Nukleinsäuren und immunreaktive Proteine aus einer Probe zu isolieren, ohne auf Strom oder Laborinfrastruktur angewiesen zu sein. Die Isolierung von Nukleinsäuren in Proteinen beginnt mit dem Mischen der Probe mit Guanidin und Thiocyanat, um die Probe aufzulysieren, und dem Durchlaufen der Mischung über das Sorbens in der Extraktionspipette. Fünfmal nach dem fünften und letzten Durchlauf über das Sorbens wird die Mischung in Puffer für die Proteinextraktion gegeben und zur Isolierung des immunreaktiven Proteins beiseitegestellt.
Anschließend werden das Sorbens und die daran gebundenen Nukleinsäuren durch Überführen von 95 % Ethanol über das Sorbens gewaschen. Mehrfach werden das Sorbens und die gebundenen Nukleinsäuren anschließend getrocknet, indem fünf Minuten lang Umgebungsluft über das Sorbens geleitet wird. Der letzte Schritt zur Gewinnung PCR-fähiger Nukleinsäuren besteht darin, die Nukleinsäuren mithilfe von 250 Mikrolitern Tris oder einer anderen ähnlichen wässrigen Lösung vom Sorbens zu eluieren, um das immunreaktive Protein zu isolieren.
Nach dem Mischen der Probe und des Proteinaufschlusspuffers die Mischung mithilfe einer zweiten Extraktionspipette 15-mal über das Sorbens leiten. Anschließend wird das Sorbens mit gebundenem Protein gewaschen, indem mehrmals 95 % Ethanol über das Sorbens geleitet wird. Danach werden das Sorbens und das daran gebundene Protein getrocknet, indem fünf Minuten lang Umgebungsluft über das Sorbens geleitet wird.
Der letzte Schritt des Protokolls besteht darin, das Protein aus dem Sorbentienmaterial zu eluieren. Letztendlich ermöglicht die in diesem Verfahren verwendete Extraktionspipette die elektrizitätsfreie Isolierung von PCR-fähigen Nukleinsäuren und immunreaktiven Proteinen. Hallo, mein Name ist Dave Pawlowski.
Ich bin leitender Wissenschaftler bei Kubrick Incorporated in Buffalo, New York, und heute werden wir eine Methode kennenlernen, mit der sowohl Proteine als auch Nukleinsäuren inline isoliert werden können, ohne dass vor der Probelyse eine Zentrifuge, ein Vortex oder sonstige zusätzliche Laborgeräte benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass die Proben in flüssiger Form vorliegen. Falls die Probe fest ist, beispielsweise Lebensmittel oder Stuhl, sollte sie in einem flüssigen Medium wie Wasser oder gepuffertem Kochsalzlösung (phosphate buffered saline) suspendiert werden.
Mischen Sie 500 Mikroliter der Probe mit 500 Mikrolitern sechs molarer Guanidin-Thiocyanat in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Danach drücken Sie den Kolben einer Extraktionspipette zusammen, um die umgebende Luft zu entlassen. Ziehen Sie das gesamte eine Milliliter umfassende Probenmaterial über das absorbierende Material in die Extraktionspipette, indem Sie den Kolben langsam expandieren lassen.
Drehen Sie das Extraktionswerkzeug um, sodass die Sorbentienperlen und die Probe in den Kolben ablaufen. Mahlen Sie die Sorbentienperlen mit der Probe im Kolben, wobei darauf zu achten ist, dass die Probe nicht aus der Extraktionspipette herausgedrückt wird.
Drehen Sie die Extraktionspipette um und geben Sie die Probe in die ursprüngliche 1,5-Milliliter-Röhrchen ab. Ziehen Sie die gesamte einkommende Probe von einem Milliliter in die Extraktionspipette, wobei Sie den Sorbentienkolben mit mäßiger Geschwindigkeit passieren. Achten Sie darauf, den Sorbentienkolben im Hals der Extraktionspipette zu halten, und drücken Sie die gesamte Probe durch Betätigen des Balgs in das 1,5-Milliliter-Röhrchen ab.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Probe insgesamt fünfmal über die Säule laufen lassen, also noch viermal zusätzlich. Nach dem fünften Durchlauf über die Säule geben Sie die gesamte einteilige Probe von einem Milliliter in vier Milliliter Puffer zur Proteingewinnung in ein 15-Milliliter-Konischgefäß ab. Mischen Sie das Gefäß durch mehrfaches Vorsichtig Umstülpen, verschließen Sie es anschließend und stellen Sie es für später beiseite.
Spülen Sie die isolierten Nukleinsäuren, indem Sie ein Milliliter 95 %igen Ethanol dreimal über die Säule laufen lassen und das Ethanol jeweils in den ursprünglichen Probengefäß zurückführen. Führen Sie nach dem letzten Durchlauf den Spülvorgang dreimal mit einem zweiten Milliliter 95 %igem Ethanol durch. Der nächste Schritt des Verfahrens ist das Trocknen der Säule; die Rückgewinnung der Nukleinsäuren gelingt am besten, wenn die Säule vollständig trocken ist.
Ich weiß, dass dieser Schritt mühsam ist. Wenn Sie diesen Schritt jedoch innerhalb des empfohlenen Zeitraums abschließen, werden Ihre Ergebnisse besser sein. Drücken und lösen Sie die Birne fünf Minuten lang.
Umgebende Luft durch die Extraktionspipette leiten, um die Nukleinsäuren und die Sorbentenschicht zu trocknen, und verbleibendes Ethanol von der Spitze der Extraktionspipette abwischen. Mit einem Kim-Tuch die Nukleinsäuren gewinnen, indem 250 Mikroliter 10 Millimolar Triss fünfmal über das Sorbent geführt werden. Der Triss-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung wie PBS ersetzt werden.
Die resultierende Lösung enthält die extrahierten Nukleinsäuren. Um zuerst die Proteinextraktion durchzuführen, mischen Sie die Probe in dem zuvor beiseitegestellten Proteinextraktionspuffer, indem Sie etwa zwei bis drei Milliliter dieser fünf Milliliter Probe über das Sorbens einer neuen Extraktion pipettieren. Geben Sie die gesamte Probe in denselben 15-Milliliter-Konikalzylinder ab. Achten Sie dabei darauf, das Sorbens im Hals der Extraktionspipette zu belassen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang. Führen Sie die Probe 15-mal über das Sorbens. Waschen Sie das Sorbens und das gebundene Protein, indem Sie dreimal je ein Milliliter 95 % Ethanol über die Sorbenssäule laufen lassen, und geben Sie das Ethanol in die ursprüngliche Probengefäßröhre ab. Führen Sie anschließend einen weiteren Waschschritt dreimal mit einem zweiten Milliliter 95 % Ethanol durch.
Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Sorbens erneut zu trocknen. Wie bei Nukleinsäuren wird die Proteinrückgewinnung am besten durchgeführt, wenn das Sorbens getrocknet ist. Für einen längeren Zeitraum.
Drücken Sie die Birne für fünf Minuten und lassen Sie sie dann los, um Umgebungsluft durch die Extraktionspipette zu leiten. Um die Proteinsorbentschicht zu trocknen, wischen Sie das restliche Ethanol von der Spitze der Extraktionspipette ab. Gewinnen Sie das Protein, indem Sie mit einem Kim-Tuch 250 Mikroliter PBS fünfmal über das Sorbens geben.
Der PBS-Puffer kann durch jede andere geeignete wässrige Lösung ersetzt werden, beispielsweise 10 Millimolar Tris, pH 6,8. Die resultierende Lösung enthält den Proteingehalt der Probe. Die mit dem enterohämorrhagischen Escherichia coli O157:H7-Stamm EDL 933 assoziierten Shiga-Toxin-Gene wurden aus einem Nukleinsäure-Protein-Extraktionsverfahren mittels der Extraktionspipette amplifiziert.
Die Shiga-Toxin-Gene, Shiga-Toxin 1 und Shiga-Toxin 2, befinden sich auf temperenten, Lambda-ähnlichen Bakteriophagen und defekten Bakteriophagen unter Kontrolle des PR-Promotors. Die Aktivierung der SOS-Antwort in E. coli führt zur Prophageninduktion und/oder Toxinproduktion. In diesem Fall kommt es zu einem starken Anstieg der Amplifikation des Shiga-Toxin-2-Gens, wenn die SOS-Antwort durch Mitomycin C induziert wird, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Dies deutet auf eine Prophageninduktion und die Replikation des Phagen-Genoms hin. Das aus den im Video beschriebenen Nukleinsäure-Protein-Isolierungsversuchen gewonnene Protein ist immunreaktiv. Die isolierte Proteinfraktion wurde auf schnelle Check-e-coli-O-1-57-Lateralfluss-Teststreifen aufgetragen.
Die Kontrollen zeigen eine positive Identifizierung in allen Proben, die E. coli O157:H7 enthalten, unabhängig von einer Shiga-Toxin-Induktion, wie durch das Vorhandensein von zwei roten Banden sichtbar gemacht wird. Die Daten zeigen außerdem positive Ergebnisse für diejenigen Proben, die E. coli O157:H7 enthielten und bei denen Nukleinsäuren und Proteine mittels der Extraktionspipette aufgearbeitet wurden. Diese Daten zeigen, dass das isolierte Protein aus jeder Probe immunaktiv ist und somit eine positive Reaktion auslöst.
Das isolierte Protein eignet sich für die Elektrophorese, wie hier in einem kumasi-gefärbten 8 %igen Acrylamid-Gel dargestellt, das mit BSA beladen wurde, das aus sechs molarem Gudina-Isothiocyanat isoliert wurde. Mithilfe der Extraktions-, Pipettier- und zugehörigen Protokollschritte entspricht die elektrophoretische Mobilität des isolierten Proteins der Kontrollproben. Sobald die Methode beherrscht ist, kann diese Technik in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis dafür haben, wie man Proteine und Nukleinsäuren aus dem einfachen Gerät isoliert. Vielen Dank, dass Sie sich die Zeit genommen haben, unser Video anzusehen.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Werkzeug und Chemikalien für die sequentielle Isolierung von Nukleinsäuren und Proteinen aus Proben ohne Strom. Die Methode verwendet ein Sorbens in einer Transferpipette und nutzt Prinzipien der Festphasenextraktion für eine effektive Isolierung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Molekulare Biologie
- Analytische Chemie
Hintergrund
- Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Nukleinsäuren und Proteinen erfordern oft Strom und spezialisierte Geräte.
- Diese Studie präsentiert eine stromfreie Alternative für die Probenverarbeitung.
- Die Methode ist auf verschiedene Probentypen anwendbar, einschließlich fester Proben.
- Verwendet Guanidinthiocyanat für die Probenlyse.
Zweck der Studie
- Zur Entwicklung einer Methode zur Isolierung von PCR-fertigen Nukleinsäuren und immunoreaktiven Proteinen.
- Um den Bedarf an Laborinfrastruktur während des Isolierungsprozesses zu eliminieren.
- Um ein benutzerfreundliches Protokoll bereitzustellen, das in Feldumgebungen durchgeführt werden kann.
Verwendete Methoden
- Probenlyse mit Guanidinthiocyanat.
- Sequenzielle Passage von Proben über ein Sorbens in einer Extraktionspipette.
- Waschen der gebundenen Nukleinsäuren und Proteine mit Ethanol.
- Elution von Nukleinsäuren und Proteinen mit wässrigen Lösungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Nukleinsäuren und Proteinen ohne Strom.
- Protokoll ermöglicht die Extraktion von PCR-fertigen Nukleinsäuren.
- Immunoaktive Proteine wurden effektiv für weitere Analysen isoliert.
- Gezeigte Anwendbarkeit für verschiedene Probentypen, einschließlich fester Proben.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode bietet eine praktische Lösung für die Isolierung von Nukleinsäuren und Proteinen.
- Sie eignet sich für den Einsatz in ressourcenbeschränkten Umgebungen.
- Dieser Ansatz kann die Forschung in verschiedenen biologischen Bereichen erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation enables rapid, field-based molecular analysis where laboratory infrastructure is unavailable. This capability supports early pathogen detection, dual biomarker validation, and streamlined sample logistics in resource-limited or decentralized settings. The approach enhances predictive confidence by allowing direct genomic and proteomic corroboration from a single sample, reducing ambiguity at critical discovery and diagnostic inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of infectious agents in diverse environments.
- Supports functional target validation by providing both nucleic acid and protein outputs from the same sample.
- Facilitates mechanistic de-risking through multi-modal biomarker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nucleic acid and protein extracts for downstream PCR and immunoassay workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing sample handling and split-sample variability.
- Enables rapid, scalable screening in field or low-resource settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field-collected samples with translational biomarker strategies by supporting both genomic and proteomic readouts.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and analytical flexibility.
- Reduces risk of false negatives by enabling redundant molecular confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, field diagnostics, and preclinical validation by enabling robust sample collection and dual-analyte extraction outside traditional labs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking for pathogen and biomarker identification.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acids and proteins for immediate or deferred analysis.
- Analytics: Provides quantitative, corroborative outputs for cross-platform comparison and decision-making.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and sample continuity from field to lab.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, reusable extraction platform adaptable to multiple sample types and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity by enabling dual molecular analysis.
- Operational Value: Standardizes extraction protocols and eliminates dependency on electricity or specialized equipment.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in decentralized or resource-limited settings.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, field-compatible sample analysis.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise for sample handling and extraction steps.
- Minimal instrumentation needed; relies on proprietary extraction pipettes and standard buffers.
- Cross-team standardization is facilitated by unified protocols for nucleic acid and protein isolation.
- Adaptable to a wide range of sample types, including liquids and solids suspended in buffer.
- Throughput is limited by manual processing; best suited for rapid, point-of-care, or low-to-moderate volume applications.
