Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Wissenschaftler im Labor und andere Interessierte mit der 3D-NA-Programmreihe auszustatten, um die räumliche Organisation von DNA und RNA mithilfe modernster computergestützter Werkzeuge zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Software zunächst aus dem 3D-NA-Forum heruntergeladen und auf einem lokalen Computer installiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine repräsentative DNA-Struktur auf der Ebene der einzelnen Basenpaarstufen zu analysieren.

Anschließend wird dieselbe DNA-Struktur auf der Ebene der Basenpaarstufen modifiziert und anschließend unter Verwendung der neu definierten Parameter für die Basenpaarstufen neu aufgebaut. Der folgende Schritt besteht in der Analyse eines großen Ensembles verwandter Strukturen. Der letzte Schritt ist die Ausrichtung einer Reihe verwandter DNA-Strukturen in einem gemeinsamen Bezugssystem, um globale Verzerrungen der Strukturen zu visualisieren.

Schließlich dienen die 3D-NA-Werkzeuge dazu, zu untersuchen, wie einzelne Basenpaarschritte – einschließlich solcher, die an Wirkstoffe und Proteine gebunden sind – zur Gesamtfaltung der DNA beitragen, und um die Stellen und Richtungen erheblicher globaler Verzerrungen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Software robust ist und breit anwendbar auf eine Vielzahl unterschiedlicher Strukturen, die Nukleinsäuren enthalten. Die Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Biochemie und Biophysik zu beantworten, beispielsweise wie Genome in drei Dimensionen organisiert sind und welche Art von Deformation die DNA eingehen kann.

Um mit der Installation des Softwarepakets zu beginnen, verbinden Sie sich mit der Website von drei DA unter xthreed.org und klicken Sie auf den Link zum 3D-NA-Forum innerhalb des Forums. Wählen Sie den Registrierungslink aus und folgen Sie den Anweisungen, um ein neues Konto zu erstellen.

Nachdem ein Benutzername und ein Passwort eingerichtet wurden, melden Sie sich im Forum an, wählen Sie im Willkommensbereich den Download-Link aus und wählen Sie auf der neuen Seite 3D NA Download. Doppelklicken Sie auf die tar-gz-Datei, um einen Ordner mit dem Namen X 3D NA dash V 2.1 zu erstellen, der die 3D-NA-Software enthält. Öffnen Sie die Terminalanwendung, die sich normalerweise unter Programme auf einem Macintosh befindet, und wechseln Sie in das Verzeichnis X 3D NA dash V 2.1.

Führen Sie das Setup-Skript aus, das für die ordnungsgemäße Funktion von 3D-NA erforderlich ist. Alle in diesem Video verwendeten Befehle finden Sie im Textprotokoll. Kopieren Sie anschließend die zwei exporteinstellungen, die auf dem Bildschirm angezeigt werden.

Wenn der Benutzer die Software im Anwendungsverzeichnis abgelegt hat, sollten die beiden Zeilen wie hier gezeigt erscheinen. Öffnen Sie die Textbearbeitungsanwendung, die sich im Anwendungsverzeichnis befindet. Wählen Sie im Menü „Format“ die Option „Klartext erstellen“.

Falls eine BRC-Datei existiert, öffnen Sie die Datei im Textmodus, bearbeiten Sie sie und fügen Sie die Exporteinstellungen am Ende der Datei ein. Falls keine Bash-RC-Datei existiert, fügen Sie die Exporteinstellungen in eine leere Datei ein und speichern Sie diese unter dem Dateinamen bash RC im Stammverzeichnis. Damit die neuen Einstellungen verfügbar werden, führen Sie die neu gespeicherte Bash-RC-Datei innerhalb des Terminalprogramms aus.

Dieses Video demonstriert die Analyse einer repräsentativen Nukleinsäurestruktur, der an das HBB-Protein aus dem Bakterium Borrelia burgdorferi gebundenen DNA. Der erste Schritt bei der 3D-NA-Analyse ist die Erstellung einer Datei, die alle gepaarten Basen auflistet. Dies erfolgt durch Eingabe eines Befehls, um das Programm Find para auf die in der Datei np_2mp_2.pdb gespeicherte atomare Struktur anzuwenden.

Der nächste Schritt in der Analyse besteht darin, die geometrischen Parameter zu bestimmen, die die Struktur charakterisieren. Der Befehl analyze verwendet als Eingabe die Basenpaar-Datei und erzeugt mehrere Ausgabedateien, die im Arbeitsverzeichnis erscheinen. Die geometrischen Werte können anschließend berechnet werden, indem man analyze two MP two bps eingibt.

Die erzeugten Ausgabedateien umfassen zwei MP zwei out, die einen Überblick über die berechneten Parameter enthält, sowie bpco step par, die eine Liste der Starrkörpereigenschaften enthält. Zusätzlich zur Analyse einer Nukleinsäurestruktur bietet die 3D-NA-Software die Möglichkeit, mithilfe des rebuild-Befehls ein Strukturmodell aus Starrkörpereigenschaften zu erstellen, um ein annäherndes atomares Modell zu generieren, das Koordinaten für Rückgrat- und Basenatome einschließt. Geben Sie den im Text aufgeführten Befehl ein. Dieser Befehl weist 3D NA an, bei der Erstellung von Modellen aus Starrkörpereigenschaften eine Standard-B-DNA-Rückgratkonformation einzuführen.

Ein Doppelhelix-Modell mit den starren Körperparametern, die in der H-B-B-D-N-A-Struktur gefunden wurden, kann anschließend durch Eingabe des entsprechenden Befehls erstellt werden. Die bpco-Schritt-Parameterdatei kann bearbeitet werden, um eine modifizierte Struktur zu erzeugen. Hier werden die extremen Rollwinkel an den beiden Stellen stärkster Biegung verändert.

Die Struktur wird anschließend mit dem modifizierten Satz von Schritt-Parametern als Eingabedatei erstellt. Die beiden Modelle können mit einem gängigen molekularen Betrachter betrachtet werden, im Gegensatz zur Analyse einer einzelnen Struktur, die Nukleinsäuren enthält. Dieser Abschnitt des Videos zeigt, wie man ein großes Ensemble von Strukturen in einer Reihe von Dateien analysiert, beginnend mit den Namen MD_unterstrich_set_eins_PDB und endend mit einer Zahl.

Der erste Schritt der Analyse besteht in der Identifizierung der Basenpaare, die durch Ausführen des „find pair“-Programms wie zuvor erhalten wurden. Da der gesamte Struktursatz dasselbe Basenpaarungsschema aufweist, muss „find pair“ nur einmal für eine repräsentative Datei ausgeführt werden, hier die Datei mit der Endung 1001. Dies erzeugt die Basenpaarungsinformation und speichert sie in der Datei MD at set one BPS PS. Der nächste Schritt ermittelt die geometrischen Parameter des gesamten Struktursatzes mithilfe des Befehls X3DNA ncore ensemble.Analyze. Anschließend können die gewünschten Starrkörperparameter aus der Übersichts-Ausgabedatei MD at set one out extrahiert werden.

Dies erfolgt mithilfe des Command X Three DCO-Ensemble-Extracts. Die Rollwinkel werden extrahiert und eine durch Komma getrennte Textdatei der Rollwinkel wird erstellt. Diese Datei kann in andere Programme eingelesen werden, um weitere Analysen und Darstellungen durchzuführen.

Die neueste Version von 3D NA verfügt über eine neue Funktion, die es einem Benutzer ermöglicht, mehrere Strukturen aus einer gemeinsamen Perspektive zu betrachten. Der X three DCO ensemble reorient-Befehl überlagert eine Sammlung verwandter Strukturen auf einem gemeinsamen Basenpaar oder Basenpaarschritt, wie in früheren Protokollen. Der erste Schritt besteht darin, die Basenpaarung der DNA mit dem find pair-Programm zu berechnen.

In diesem Fall besteht die Eingabedatei aus zwei KEK-pdb-Dateien, die die 10 Strukturen des CIA coli, O 3D NA-Operators im Komplex mit dem Kopfbereich des LAC-Repressorproteins enthalten. Der Befehl X drei DCO-Ensembleumorientierung richtet die einzelnen Modelle einer Multimodellstruktur in einem gemeinsamen Bezugssystem aus. Für diesen Befehl werden sowohl die PDB-Datei als auch die Basenpaarungsdatei aus dem vorherigen Schritt als Eingabe benötigt.

Ebenfalls in dem Befehl enthalten ist die Identität des Basenpaarschritts, an dem alle Strukturen ausgerichtet werden. Die W3DNA-Web-Schnittstelle umfasst einige beliebte Funktionen des 3DNA-Softwarepakets. Dieser Teil des Videos hebt die Fähigkeit hervor, dreidimensionale Modelle von proteinbesetzter DNA mittels des Web-Servers zu erstellen.

Der erste Schritt beim Erstellen eines mit Proteinen dekorierten DNA-Modells ist der Besuch der W 3D NA-Website unter W three d.rutgers.edu. Die Auswahl von „Reconstruction“ im Menü oben links auf der Seite aktiviert die Online-Modellerstellungsfunktionen. Als Nächstes wählen Sie den Link zur gebundenen Protein-DNA-Vorlage aus, der sich in der leicht schattierten Box in der Mitte der neuen Seite befindet.

Diese Auswahl aktiviert ein Dropdown-Menü, das es dem Benutzer ermöglicht, die Anzahl der gebundenen Proteine anzugeben. Die Auswahl der Anzahl gebundener Proteine führt zu einer neuen Spezifikationsseite. Der Benutzer kann dann die gewünschte Sequenz eingeben oder einfügen.

Im Textfeld in der Mitte der neuen Seite befindet sich ein Dropdown-Menü unterhalb des Textfelds, um die helikale Konformation der ungebundenen DNA-Bereiche auszuwählen. Ganz unten auf der Spezifikationsseite befindet sich ein Textfeld, in das die Bindungspositionen und Dateinamen der gebundenen Proteine eingegeben werden können. Die Bindungsposition gibt den Ort des Zentrums des gebundenen Proteinfragments in der DNA-Sequenz an.

Am unteren Rand der Spezifikationsseite befindet sich ein Feld, das es dem Benutzer ermöglicht, eine Vorschau der DNA mit gebundenem Protein zu erzeugen. In diesem Fall ist dieses Feld aktiviert und die Schaltfläche „Weiter“ wird angeklickt. Diese Aktion erzeugt eine Übersichtsseite, auf der die ausgewählten Parameter sowie eventuelle Fehler aufgelistet sind, die aus der Überlappung der ausgewählten Bindungsstellen entstanden sein könnten.

Der Benutzer kann die Zurück-Taste auswählen, falls Änderungen erforderlich sind, oder die Erstellen-Taste, um fortzufahren. Auf der nächsten Seite wird ein Standbild des DNA-Protein-Komplexes in seiner maximal ausgestreckten Anordnung angezeigt, und es ist eine interaktive Online-Visualisierung über das Web möglich. Der Benutzer kann außerdem eine Datei mit atomaren Koordinaten herunterladen.

Die 3D-NA-Softwaretools werden routinemäßig zur Analyse von Nukleinsäurestrukturen verwendet. Die Werte der Starrkörpereigenschaften zeigen Verzerrungen in der dreidimensionalen Struktur auf, wie beispielsweise die beiden Stellen starker DNA-Biegung in die große Furche mit großen positiven Rollwinkeln an den Positionen 13 und 22 im Kristallkomplex der DNA mit dem Borrelia-Burgdorferi-RHBB-Protein.

Die Fähigkeit der Software, Strukturen aus diesen Größen neu aufzubauen, ermöglicht es zu bestimmen, wie einzelne Basen- und Basenpaarschritte zur gesamten molekularen Faltung beitragen. Wie hier veranschaulicht, spiegelt die globale Krümmung der DNA, die durch HBB induziert wird, mehr wider als nur die beiden oben genannten extremen Rollverzerrungen. Die DNA bleibt stark gekrümmt, wenn sie mit gestreckten Basenpaarschritten rekonstruiert wird.

Dabei wurden die beiden größten Werte der Rolle auf null gesetzt. Die neue Funktion in 3D NA, eine große Anzahl verwandter Strukturen zu untersuchen, ermöglicht es, sowohl sequenz- als auch zeitabhängige Muster in der räumlichen Anordnung simulierter DNA- und RNA-Moleküle zu extrahieren. Beispielsweise zeigt die gelbe Farbschichtung der Rollwinkel zwischen aufeinanderfolgenden Basenpaaren in zwei großen Sätzen simulierter DNA-Strukturen die bevorzugte Biegung dieser Moleküle an Permian-Purin-Basenpaar-Schritten auf.

Die höheren, in Rot dargestellten Rollwerte, die an den Enden der DNA über kurze Zeiträume bestehen bleiben, deuten auf eine lokalisierte Schmelzung und erneutes Knien der Doppelhelixstruktur hin. Die variationsreichen Muster anderer Starrkörpereigenschaften, wie die Winkel und Abstände zwischen komplementären Basen, können helfen, die genauen strukturellen Verzerrungen zu entschlüsseln. Die Fähigkeit der 3D-NA-Software, verwandte Moleküle in einem gemeinsamen Bezugssystem neu auszurichten, macht strukturelle Merkmale sichtbar, die in vielen der im Protein Data Bank gespeicherten Dateien verborgen bleiben.

Beispielsweise erzeugt die herkömmliche Ausrichtung verwandter Strukturen auf der Grundlage eines mittleren quadratischen Fits entsprechender Atome eine Reihe ähnlicher räumlicher Verläufe, die hier grob übereinander liegen: die 10 NMR-basierten Modelle des Escherichia coli, O3D-NA-Operators, der an die Kopfstücke des Lac-Repressorproteins gebunden ist. Die Überlagerung derselben Strukturen in einem gemeinsamen Koordinatensystem auf dem fünfsträngigen terminalen Basenpaar jedes Duplexes zeigt erhebliche Verzerrungen der Gesamtstruktur, bei denen sich die Moleküle in deutlich unterschiedliche Richtungen verbiegen. Die strukturelle Variabilität kann die Leichtigkeit beeinflussen, mit der das Escherichia coli-Lac-Repressorprotein O3 erkennt und eine Schleife zwischen O3 und sequenziell entfernten Operatoren in der Lac-Operon-Regulation induziert. Wie hier veranschaulicht, kann die genaue Positionierung eines architektonischen Proteins wie HBB aus Borrelia burgdorferi eine dramatische Wirkung auf die Gesamtfaltung der DNA haben.

Wenn zwei Kopien der bekannten Struktur mit hoher Auflösung durch 43 Basenpaare voneinander getrennt sind, schließt sich ein 81 Basenpaare langes DNA-Fragment zu einer engen, nahezu kreisförmigen Konfiguration. Wenn die beiden Proteine zusätzlich durch fünf Basenpaare voneinander getrennt sind, verläuft die DNA entlang eines offenen, verschlungenen Pfads. Die sehr unterschiedlichen Anordnungen des mit Proteinen besetzten Doppelstrangs zeigen, wie der Abstand architektonischer Proteine die Zirkularisierung oder Schleifenbildung der DNA nach ihrer Entstehung beeinflussen kann.

Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der strukturellen Biologie der Nukleinsäuren den Weg, um DNA-Protein-Wechselwirkungen, RNA-Faltung und Nanopartikeldesign zu untersuchen, um ein besseres Verständnis von Entwicklungsstörungen und Krankheiten wie Krebs zu erlangen und neue Therapeutika zu entwickeln.