High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue Verbindungen zu entdecken, die die Aktivität von inward-rectifier-Kaliumkanälen modulieren. Dies wird erreicht, indem zuerst tetracyclin-induzierbare HK 2 9 3-Zellen, die einen KIR-Kanal der gewünschten Spezifität exprimieren, in einer 384-Well-Platte ausplattiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit einem fluoreszierenden Thallium-Reportersfarbstoff namens flu in two zu beladen.

Anschließend wird der nicht eingebaute Farbstoff aus den Zellen ausgewaschen und durch Assaypuffer mit einem Fahrzeugkontrollmittel oder Testverbindungen ersetzt. Im letzten Schritt wird ein Stimulationspuffer in die Vertiefungen gegeben, um den Thallium-Fluss einzuleiten. Abschließend wird ein Fluoreszenz-Plattenreader verwendet, um die Verbindungen zu identifizieren, die die Bewegung von Thalliumionen durch den KIR-Kanal verändern. Schlecht.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der manuellen Patch-Clamp-Elektrophysiologie liegt darin, dass der Untersucher Hunderte von Experimenten gleichzeitig und Tausende von Experimenten pro Tag durchführen kann. Diese Methode ermöglicht es dem Untersucher, Bibliotheken mit Tausenden von kleinen Molekülen daraufhin zu screenen, ob sie Modulatoren von einwärts gerichteten Kaliumkanälen beeinflussen. Einen Tag vor dem Thallium-Flux-Experiment die Zellen lösen und die Dichte der Zellsuspension quantifizieren, wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben. Anschließend das BH-Medium mit 10 % dialysiertem FBS verwenden, um 20.000 monoklonale Zellen, die stabil mit einem Gen für einen KIR-Kanal der Wahl transfiziert wurden, in jede Vertiefung einer BD PureCoat Amin-beschichteten 384-Loch-Platte mit einem Thermo Multi Drop Combi oder einer Mehrkanalpipette zu geben. Am nächsten Tag die Platte unter dem Mikroskop überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen anhaftend sind und gleichmäßig über den Boden der Vertiefungen verteilt sind.

Verwenden Sie anschließend einen ELX 405 Mikroplattenwascher, um das Zellkulturmedium durch HBSS-Assaypuffer mit je 20 µL pro Vertiefung zu ersetzen. Danach bereiten Sie das Flus in der 2:00 AM D-Lösung vor, indem Sie das Röhrchen kurz zentrifugieren, um 50 µg Flus in zwei Pulver in 100 µL wasserfreiem DMSO aufzulösen.

Geben Sie nun 50 Mikroliter einer 20 % (Gewicht pro Volumen) Onic F1 27 DMSO-Lösung zum Farbstoff hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Anschließend geben Sie 150 Mikroliter Flus in 2:00 AM Onic F1 27 zu 35 Millilitern HBSS-Assaypuffer und mischen vorsichtig.

Fügen Sie anschließend 20 Mikroliter Farbstoff-Lade-Puffer in jede Vertiefung hinzu, die bereits 20 Mikroliter HBSS-Assay-Puffer enthält. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde, während die Zellen mit dem Farbstoff beladen werden. Bereiten Sie eine Thallium-Stimulationsplatte vor, indem Sie 0,5 Gramm Natriumbicarbonat frisch in 50 Milliliter 5x-Thallium-Stimulationspuffer auflösen.

Als Nächstes 50 Mikroliter der Lösung in jedes Brunnen einer Polypropylen-Mikrotiterplatte mit 384 Brunnen geben, nachdem die Zellen um 2:00 Uhr morgens mit Flus beladen wurden. Die Platte mit einem ELX 405 Mikrotiterplattenwascher waschen. Danach 20 oder 40 Mikroliter HBSS-Assaypuffer zurück in jeden Brunnen geben. Die Platte ist nun bereit für die Experimente.

Laden Sie die Thallium- und Zellplatten in ein funktionales Wirkstoff-Screening-System vom Typ Hema Matsu oder ein gleichwertiges kinetisches Bildgebungs-Plattenlesegerät mit integrierter Flüssigkeitsdosierung und verwenden Sie geeignete Filter für auf Fluorescein basierende Farbstoffe wie flu oh four. Richten Sie danach ein Einzelschritt-Zudosierungsprotokoll ein, um 10 Mikroliter einer fünffach konzentrierten Thallium-Lösung zu den entsprechenden Vertiefungen der Zellplatte hinzuzufügen, die 40 Mikroliter HBSS-Assaypuffer enthalten. Nehmen Sie anschließend die Basislinien-Fluoreszenz mit einer Abtastrate von einem Hertz über mindestens 10 Sekunden auf.

Die Fluoreszenz von Vertiefung zu Vertiefung sollte gleichmäßig und stabil über die gesamte Platte sein, sobald optimale Bedingungen für das Zellausplattieren, Waschen und Beladen etabliert sind. In der Zwischenzeit verwenden Sie den integrierten 384-Kanal-Pipettierer, um den Thallium-Stimulationspuffer gleichzeitig in jede Vertiefung zuzugeben, und setzen die Aufzeichnung für mindestens zwei Minuten fort, damit die Rate und das Maximum des thalliuminduzierten Anstiegs der Fluoreszenz für die nachträgliche Analyse erfasst werden. In der nächsten Versuchsreihe bewerten Sie die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays, indem Sie in jeder Spalte und Reihe einer 384-Vertiefungs-Platte in jeder zweiten Vertiefung einen Kontrollinhibitor ausplattieren und in die übrigen Vertiefungen DMSO als Fahrzeugkontrolle hinzufügen.

Verwenden Sie einen Mehrkanalpipettierer. Stellen Sie eine Verbindung-DMSO-Platte her, indem Sie einen Inhibitor des Ziel-KIR-Kanals in der zuvor bestimmten Konzentration mit 80 Mikroliter pro Vertiefung und 0,1 % DMSO als Fahrzeug in eine 384-Loch-Polypropylenplatte pipettieren. Dies erfolgt, indem ein bekannter Inhibitor beginnend in Vertiefung A1 hinzugefügt wird, anschließend alternierend in Vertiefung B2 und so weiter bis hin zu Vertiefung B24.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit DMSO, beginnend in Vertiefung B1 und so weiter bis Vertiefung A24. Laden Sie nun die Zell-, Verbindungsmittel- und Thalliumstimulationsplatten in das Plattenlesegerät. Richten Sie anschließend ein zweifaches Zugabeprotokoll ein, um 20 Mikroliter der zweifachen Konzentration der Verbindungsserie zu den entsprechenden Vertiefungen der Zellplatte hinzuzufügen, die 20 Mikroliter HBSS-Assaypuffer enthalten.

Fügen Sie die Verbindungen der Zellplatte hinzu und inkubieren Sie sie bis zu 20 Minuten bei Raumtemperatur. Registrieren Sie die Basislinienfluoreszenz in zwei Fluoreszenzkanälen mindestens 10 Sekunden lang. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Fünf-x-Thallium-Puffer in jedes Loch der Zellplatte.

Wiederholen Sie das Experiment an drei aufeinanderfolgenden Tagen, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen. Verwenden Sie den Thallium-Fluss in DMSO- und in mit Wirkstoff behandelten Zellen, um einen Wert für Z-Prime zu berechnen. Ein statistisches Maß für die Variabilität von Vertiefung zu Vertiefung zwischen den beiden Populationen von Vertiefungen, berechnet Z-Prime anhand dieser Formel, die auf den Mittelwerten und Standardabweichungen von P und N basiert, wobei P den uninhibierten Flusswert und N den vollständig inhibierten Flusswert darstellt.

Ein Assay mit ZPrime-Werten größer oder gleich 0,5 an drei verschiedenen Tagen gilt als geeignet für das Hochdurchsatz-Screening. Diese Abbildungen zeigen einige Beispiele der Zellansäte-Karten, die in verschiedenen Experimenttypen verwendet werden. Die Positionen der Vertiefungen mit nicht induzierten oder mit Tetracyclin induzierten Zellen sind in unterschiedlichen Farben gekennzeichnet.

Diese Abbildung zeigt die Quellplattenkarte, die zur Bestimmung der optimalen Thalliumkonzentration für die Assay-Entwicklung und die Substanzs screening verwendet wurde. Das Farbverlaufsmuster repräsentiert die dreifache Verdünnungsreihe im Bereich von 100 % bis 0,002 % Thallium, und hier ist eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte mit kühlen bis warmen Farben dargestellt, die niedrige bis hohe Thallium-Flusswerte anzeigen. Die hier gezeigte Zellplattierungskarte mit Anpassung einer vierparametrigen logistischen Funktion an die Thallium-Konzentrations-Wirkungs-Kurve (CRC) dient zur Bestimmung eines EEC-80-Werts von 15 % Thallium.

Diese Abbildung zeigt die Quellplattenkarte, die zur Bestimmung der DMSO-Toleranz eines Assays verwendet wurde. Die Spalten eins und 24 enthalten nur Assaypuffer, während der Farbverlauf die zweifache Verdünnungsreihe von 10 % bis 0,01 % DMSO angibt, sowie eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte, bei der niedrige Thallium-Flusswerte durch dunkleres Blau gekennzeichnet sind. Die durchschnittlichen Thallium-Flusswerte, die aus den Vertiefungen mit den angegebenen DMSO-Konzentrationen aufgezeichnet wurden, sind hier zusammengefasst.

Nun zeigt diese Abbildung die Quellplattenkarte, die zur Erstellung von Konzentrations-Wirkungs-Kurven für bekannte Inhibitoren eines KIR-Kanals verwendet wurde. Jede Verbindung ist mit einer anderen Farbe gekennzeichnet und wird typischerweise als dreifache Verdünnungsreihe aufgetragen. Hier ist eine repräsentative Fluoreszenzintensitätskarte dargestellt, und diese Abbildung zeigt die dosisabhängige Hemmung des Thallium-Flusses durch einen Inhibitor nach der Entwicklung und Optimierung.

Der Thallium-Fluss-Assay kann ebenfalls zur Durchführung einer Vielzahl routinemäßiger pharmakologischer Assays eingesetzt werden. Der Thallium-Fluss-Assay wurde bereits früher für die Anwendung mit spannungs- und ligandenaktivierten Kaliumkanälen, nichtselektiven Kationenkanälen und sogar Kaliumtransportern angepasst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Thallium äußerst gefährlich sein kann und stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Handschuhen sowie eine geeignete Entsorgung von Abfällen getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.