Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Bakterien mithilfe elektrochemischer Sensoren nachzuweisen und zu identifizieren. Dazu wird zunächst die ribosomale RNA aus den Bakterien freigesetzt, um im zweiten Schritt eine Hybridisierung mit der fluorinierten Detektorsonde zu ermöglichen. Anschließend wird die an die ribosomale RNA gebundene Detektorsonde auf die Arbeitselektrode aufgebracht, wodurch eine Hybridisierung mit der Capturesonde auf der Sensorentfläche erfolgen kann. Danach wird der Anti-Fluorescein-Peroxidase-Konjugat aus Rettich (Anti-fluorescein horse radish peroxidase conjugate) an die fluorinierte Detektorsonde binden gelassen.

Schließlich kann bei der interferometrischen Strommessung eine Intensität gewonnen werden, die mit der Anzahl der Ribosomen-RNA-Detektorsonde-Komplexe auf der Sensoroberfläche korreliert ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber kulturbasierten Methoden liegt darin, dass Bakterien innerhalb von etwa 45 Minuten detektiert und identifiziert werden können, wodurch die Notwendigkeit einer Übernachtkultur entfällt. Bei der Anwendung dieser Technik zur Detektion von Bakterien, die auf einer EDGAR-Platte eine sichtbare Kolonie bilden, könnte die Behandlung von Infektionskrankheiten verbessert werden.

Da die Früherkennung bakterieller Krankheitserreger für eine gezielte antibiotische Therapie und verbesserte klinische Ergebnisse unerlässlich ist. Obwohl diese Methode zur Diagnose von Infektionskrankheiten nützlich ist, kann sie auch auf andere diagnostische Probleme wie die Immunodiagnose angewendet werden. Inkubieren Sie zunächst die verdünnte Capture-Sonde gemeinsam mit Hexan-Dithiol für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass die Thiolgruppe an der Capture-Sonde reduziert wird, was zu konsistenteren Ergebnissen führt.

Nach der Inkubation einen Strom von Stickstoff auf den Goldsensor der 16-Sensor-Array-Chips für fünf Sekunden leiten, um Feuchtigkeit oder Partikel zu entfernen. Geringe Flüssigkeitsmengen müssen sorgfältig auf die Arbeitselektrode im Sensorarray aufgetragen werden. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend.

Da die ordnungsgemäße Durchführung der Pipettier- sowie der Wasch- und Trocknungstechniken die Variabilität von Chip zu Chip erheblich verringert, tragen Sie anschließend sechs Mikroliter der verdünnten HDT-Erfassungsprobemischung auf die Arbeitselektrode aller 16 Sensoren des Sensorarrays auf und lagern Sie die Sensorchips über Nacht in einer abgedeckten Petrischale bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag waschen Sie die Sensorchips zwei bis drei Sekunden lang mit entionisiertem Wasser und trocknen die Chips danach fünf Sekunden lang unter einem Stickstoffstrom. Geben Sie nun sechs Mikroliter der Lösung aus Atrihydrochlorid, Natriumchlorid, EDTA und Mercaptoethanol auf die Arbeitselektrode aller 16 Sensoren und inkubieren Sie die Sensoren 50 Minuten lang in einer Petrischale bei Raumtemperatur.

Um die Proben für den elektrochemischen Sensorsatz vorzubereiten, überführen Sie ein Milliliter bakterielle Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend fünf Minuten bei 16.000 ×g. Beachten Sie, dass pathogene Bakterien in einer Biosicherheitswerkbank gehandhabt werden sollten.

Nach dem Entfernen des snat wird eine Pipettenspitze, die 10 Mikroliter einer einmolarigen Natriumhydroxidlösung enthält, an den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens angebracht, und die Probe wird mehrmals auf- und abpipettiert, um das Pellet vollständig in Suspension zu bringen. Nach einer fünfminütigen Inkubation der Suspension bei Raumtemperatur werden 50 Mikroliter PBS mit Rinderserumalbumin oder BSA sowie eine mit Fluorescein markierte Detektorsonde hinzugefügt, um das bakterielle Lysat zu neutralisieren. Anschließend wird das neutralisierte Lysat 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Beginnen Sie diesen Schritt damit, dass Sie die Mercaptoethanol-Lösung von einem der vorbereiteten Sensorchips zwei bis drei Sekunden lang mit entionisiertem Wasser waschen. Nachdem der Chip wie zuvor gezeigt getrocknet wurde, geben Sie vier Mikroliter des neutralisierten Bakterienlysats auf die Arbeitselektroden. 14 der Sensoren.

Dann vier Mikroliter des vermittelnden Oligonukleotids in PBS mit BSA und fluoresceinmarkiertem Detektorprobe auf die beiden positiven Kontrollsensoren auftragen. Nach einer 15-minütigen Inkubation der Lysate und der positiven Kontrollsensoren die gesamte Sensorchip-Oberfläche wie zuvor waschen und trocknen. Anschließend vier Mikroliter Anti-Fluorescein-Horseradish-Peroxidase (HRP) in PBS mit Casein auf die Arbeitselektroden aller 16 Sensoren auftragen.

Nach einer 15-minütigen Inkubation waschen und trocknen Sie den Sensorchip. Anschließend bringen Sie einen Film-Well-Sticker auf der Oberfläche des Sensorchips an und geben mithilfe einer Pipette 50 Mikroliter TMB-Substrat auf alle 16 Sensoren; danach schließen Sie die Sensorchip-Halterung. Abschließend verwenden Sie einen Helios-Chip-Reader, um Pyrometrie- und zyklische Telemetriemessungen für alle 16 Sensoren zu erhalten.

Der gerade beschriebene elektrochemische Assay ist ähnlich aufgebaut wie ein Sandwich-ELISA, wie in dieser Abbildung gezeigt: Die Hybridisierung der Ziel-Ribosomen-RNA mit den Capture- und Detektorproben wird durch eine Redoxreaktion vermittelt, die von HRP katalysiert wird, das an Anti-Fluorescein-Antikörperfragmente gekoppelt ist und die dreifache Fluorescein-Verknüpfung auf der Detektorprobe bindet. Eine wichtige Komponente der Empfindlichkeit des Assays ist die Oberflächenchemie der Goldelektrode. Die Goldelektrode ist mit Mercaptoethanol und Hineol beschichtet und durch Zugabe von verdünnten Captureproben funktionalisiert.

Die Sandwich-Hybridisierung der Ziel-Ribosomen-RNA mit der Capture-Sonde und der mit Fluorescein markierten Detektor-Sonde führt zu einem Komplex, der durch Zugabe des Anti-Fluorescein-Konjugats mit Meerrettichperoxidase und des TMB-Substrats nachgewiesen wird. Der M-parametrische Strom wird durch den Redoxzyklus erzeugt, der aus der Oxidation von TMB durch Meerrettichperoxidase und der anschließenden Reduktion von TMB durch Elektronen von der Elektrode resultiert. Die hier dargestellten Assays verwenden einen genfluidischen Chip mit einem 16-Sensor-Array.

Jeder der Sensoren im Array enthält drei Elektroden – Arbeitselektrode, Referenzelektrode und Hilfselektrode –, die über Kontaktstellen am Rand des Chips verfügen. Der Chip-Lesegerät verfügt über Federstifte (Pogo-Pins), die mit jeder dieser Kontaktstellen verbunden sind. Das Chip-Lesegerät dient als Schnittstelle zwischen dem Sensorarray und einem von einem Computeralgorithmus gesteuerten Potentiometer.

Hier werden Beispiele für den Stromfluss bei einem elektrochemischen Sensor gezeigt. Der Stromfluss in den Sensoren ist in den ersten Sekunden nach Beginn der parametrischen Messungen künstlich hoch. Aufgrund der Ansammlung oxidierten Substrats während des Zeitraums zwischen der Applikation von TMB auf die Sensorsfläche und dem Start des Leseralgorithmus erreicht der Stromfluss anschließend schnell einen stabilen Zustand, und zuverlässige Sensorablesungen können innerhalb von 60 Sekunden gewonnen werden.

Die Variabilität von Sensor zu Sensor ist relativ konstant, sodass es möglich ist, 16 verschiedene Sensor-Assays parallel auf dem genfluiddichten 16-Sensor-Array-Chip durchzuführen. Positive und negative Kontrollen sind unerlässlich; als positive Kontrolle dient ein synthetisches vermittelndes DNA-Oligonukleotid, das an sowohl die Capture- als auch die Detektorsonden hybridisiert und als synthetisches Target bekannter Konzentration fungiert. Die mit dem vermittelnden Oligonukleotid erzielten Ergebnisse wirken als interne Kalibrierkontrolle, um die Variation von Chip zu Chip zu minimieren.

Je größer der negative Strom der Elektrode ist, desto höher ist das Signal. Bei der Prüfung von Capture- und Detektorsonden sollte die Nachweisgrenze durch serielle Verdünnung einer Probe mit bekannter Konzentration bestimmt werden, wie in dieser Abbildung dargestellt. Im dynamischen Bereich des Assays besteht eine lineare logarithmische Korrelation zwischen der Probenkonzentration und dem Signalausgang.

In diesen Balkendiagrammen werden die repräsentativen Ergebnisse für Proben gezeigt, die E. coli und Kleb. pneumoniae sowie Ammoniak enthalten, die häufig im Urin von Patienten mit Harnwegsinfektionen vorkommen. Die Signale für die meisten Sensoren sind niedrig und ähnlich, und diese negativen Ergebnisse können als Hintergrundsignal zusammengefasst werden. Die Reaktivität mit dem KE-Sondenpaar unterscheidet Klebsiella von E. coli. Das vermittelnde Oligonukleotid dient als positiver Kontrollwert und interner Kalibrierstandard. Diese Technik kann zur Detektion antibiotikaresistenter Bakterien in klinischen Proben angewendet werden, indem die phänotypische Reaktion der Bakterien auf Antibiotika gemessen wird.

Mithilfe dieser Technik kann die optimale Therapie für einen einzelnen Patienten bestimmt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bakterien detektiert und identifiziert, indem man die atrialen Ströme in den artspezifischen Sensoren des Chips vergleicht.