Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die das Wachstum von C. elegans und die Körperlänge regulieren. Mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) zur Inaktivierung von Kandidatengenen werden zunächst Platten mit Bakterien vorbereitet, die doppelsträngige RNA exprimieren, die gegen die Gene von Interesse gerichtet ist. Hermaphroditen im vierten Larvenstadium werden auf die RNAi-Platten übertragen.

Sobald sie das Stadium des jungen Erwachsenen erreichen, werden sie auf neue RNAi-Platten transferiert, um Eier abzulegen. Nach mehreren Stunden werden sie entfernt, wodurch synchronisierte Populationen von Embryonen entstehen. Im gewünschten Entwicklungsstadium werden die Nachkommen gesammelt und auf Objektträger aufgebracht.

Schließlich werden mikroskopische Aufnahmen der Würmer angefertigt. Die Analyse der Bilder zeigt Veränderungen der Körperlänge infolge der Geninaktivierung. Obwohl diese Methode zur Identifizierung von Regulatoren des TGF-beta-Signalwegs verwendet werden kann, ist sie ebenso auf andere Signalwege anwendbar, die die postembryonale Entwicklung bei *C. elegans* steuern, wie beispielsweise den Insulin-Signalweg.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Zielgen-Sequenzen in den Vektor L 4 4 4 0 A, ein häufig verwendetes Wurm-RNAi-Plasmid, klonen, und transformieren Sie das rekombinante Plasmid in den Bakterienstamm HT one 15 DE three. Kultivieren Sie die transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Carbenicillin und 12,5 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin und pflücken Sie anschließend einen einzelnen Klon für die spätere Verwendung.

Unterdessen transformieren Sie den leeren Vektor L 4 4 4 0 in den Bakterienstamm HT one 15. Verwenden Sie dies als Kontrolle für die Experimentkultur, indem Sie die transformierten Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Milliliter LB-Brühe mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin kultivieren.

Tetracyclin wird nicht hinzugefügt, da es die RNAI-Effizienz verringert. Geben Sie weitere fünf Milliliter LB-Brühe mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin zur Übernachtkultur hinzu und inkubieren Sie weitere vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Sobald die Kultur bereit ist, impfen Sie 0,5 Milliliter experimenteller oder kontrollbakterieller Kultur auf die mit dem entsprechenden Klownamen beschrifteten RNAI-Wurmplatten aus.

Für jede Bedingung sollten mindestens zwei Platten vorbereitet werden. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag.

Es sollte ein Rasen aus Bakterien vorhanden sein, die RNAi mit oder ohne die Zielgen-Sequenz exprimieren. Die Tiere nutzen die Bakterien als Nahrungsquelle. Sobald die RNAi-Fütterungsplatten bereit sind, wird die Spitze eines Platindrahts durch Flamme sterilisiert.

Verwenden Sie dann den Platindraht, um sechs bis zehn Fadenwürmer im vierten Larvenstadium oder L4-C.-elegans-Hermaphroditen auf jede RNAi-Platte zu übertragen. Lassen Sie die Hermaphroditen über Nacht bei 20 Grad Celsius wachsen. Am nächsten Tag werden die Tiere junge adulte Tiere sein.

Überführen Sie sie auf eine neue, entsprechend beschriftete und vorbereitete RNAi-Platte. Inkubieren Sie die Platten bei 20 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden, um den erwachsenen Tieren das Ablegen von Eiern zu ermöglichen. Entfernen Sie nach der Inkubation alle erwachsenen Tiere von der Platte, um die Nachkommen zu synchronisieren.

Sobald die erwachsenen Tiere entfernt wurden, beginnen Sie mit der Zeitmessung. Dies ist der Zeitpunkt null. Inkubieren Sie die Platten bei 20 Grad Celsius, damit die Tiere bis zum gewünschten Entwicklungsstadium heranwachsen können.

Hier werden junge Erwachsene für die phänotypische Analyse ausgewählt. Für Knockdowns, die sich mit normaler Geschwindigkeit entwickeln, ist eine Inkubation von 72 Stunden erforderlich. Beachten Sie, dass verschiedene Gene die Entwicklung der Tiere unterschiedlich beeinflussen, sodass die Inkubationszeiten angepasst werden müssen.

Wenn die RNAi dazu führt, dass sich die Tiere mit einer anderen Geschwindigkeit entwickeln, können junge adulte Tiere als solche identifiziert werden, die nicht mehr als 24 Stunden nach dem L4-Stadium liegen, eine vollständige VUL-Entwicklung aufweisen und zwei bis sechs Embryonen im Uterus besitzen, wie hier gezeigt. Um andere Entwicklungsstadien zu identifizieren, sollte der Untersucher die Entwicklung der Gonaden und der VUL als Leitmerkmale heranziehen. Sobald die Tiere das geeignete Entwicklungsstadium erreicht haben, bereiten Sie sich darauf vor, die Körpergrößen-Phänotypen der mit RNAi behandelten Würmer zu erfassen.

Als Nächstes bringen Sie zwei Schichten farbiges Etikettierband auf einem einen Millimeter dicken Glasobjektträger an, wie hier gezeigt. Stellen Sie zwei dieser Glasobjektträger her. Dann legen Sie einen neuen Objektträger zwischen die beiden Objektträger mit dem Band und geben einen Tropfen 2 % Agros, das in Wasser geschmolzen ist, darauf.

Drücken Sie eine zweite Objektträgerplatte in die Mitte der neuen Objektträgerplatte, um ein dünnes Agar-Kissen zu erzeugen. Sobald der Agar erstarrt ist, entfernen Sie die obere Glasplatte. Der Objektträger mit dem Agar-Kissen ist bereit, um Würmer aufzunehmen.

Beschriften Sie den Objektträger mit dem Klonnamen. Geben Sie 10 Mikroliter einer 25 Millimolar konzentrierten Natriumazidlösung auf das Aros-Polster. Überführen Sie dann mithilfe eines Platindrahts wie zuvor 30 bis 40 Tiere in die Natriumazidlösung.

Um sie zu fixieren, legen Sie einen Deckgläser auf die Probe. Führen Sie dies sowohl bei rekombinanten als auch bei leeren L 4 4 4 0 tragenden Tieren, die mit RNAi behandelt wurden, durch. Als Nächstes platzieren Sie den Objektträger mit Mikrometerskala unter das Stereomikroskop mit einem 2,5×-Objektiv.

Unter Verwendung von Q Capture oder einer ähnlichen Software ein Bild des Mikrometerrasters aufnehmen und speichern. Anschließend die Würmer unter das Mikroskop legen und Bilder aufnehmen. Um zunächst die Körperlänge zu messen, das Bild des Mikrometerrasters in der Image-Pro-Software öffnen.

Dann klicken Sie auf „Messen“ und wählen Sie Kalibrierung. Wählen Sie anschließend den räumlichen Kalibrierungs-Assistenten mit ausgewähltem „Kalibriere das aktive Bild“. Klicken Sie auf „Weiter“.

Geben Sie den Namen für die Kalibrierung ein und stellen Sie sicher, dass die räumlichen Bezugseinheiten auf Mikrometer eingestellt sind. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen „Create a reference calibration“ und klicken Sie auf „Next“. Klicken Sie anschließend auf „draw reference line“.

Ein Referenzmaßstab wird angezeigt. Positionieren Sie den Maßstab so, dass er mit den Enden des Mikrometers übereinstimmt. Geben Sie anschließend an, dass die Referenz 1000 Einheiten angibt.

Klicken Sie auf „Okay“. Danach „Weiter“ und „Fertig“. Sobald die Software kalibriert ist, öffnen Sie ein Wurmbild.

Danach im Messmenü die Kalibrierung auswählen und anschließend auf „räumliche Auswahl“ klicken. Im Dropdown-Menü den für die Mikrometerkalibrierung erstellten Dateinamen auswählen. Danach im Messmenü im sich öffnenden Fenster „Messungen“ auswählen.

Wählen Sie das Freihand-Werkzeug aus und zeichnen Sie mit der Computermaus eine Linie durch die Körpermitte des Tieres vom Kopf bis zum Schwanz. Die Länge wird im Fenster angezeigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Tiere im Sichtfeld.

Exportieren Sie die Längenmessungen in eine Microsoft Excel-Datei oder eine andere geeignete statistische Software. Analysieren Sie die Daten, indem Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Probe berechnen. Vergleichen Sie anschließend die Ergebnisse für jede Gruppe mithilfe eines Student-t-Tests.

Das Protein DBL-1 der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors Beta oder TGF-beta ist für die Aktivierung des TGF-beta-Signalwegs erforderlich. Als Reaktion auf die Signalaktivierung wandern die intrazellulären Smad-Signalüberträger in den Zellkern und initiieren die Genexpression. C. elegans, in denen der TGF-beta-Signalweg gestört ist, weisen eine geringere Körpergröße auf, einschließlich einer kürzeren Körperlänge im Vergleich zu Wildtyp-Tieren.

Somit ermöglichen Bildschirmtests an C. elegans die Identifizierung von Komponenten und Modulatoren des TGF-beta-Signalwegs sowie die Überprüfung der Wirksamkeit der RNAi durch Fütterung zur Identifizierung von Mutanten mit veränderter Körperlänge. Mittels RNAi wurden die Komponenten SMA-3 und SMA-6 des DBL-1-Signalwegs in vier verschiedenen Stämmen von C. elegans herunterreguliert.

Die getesteten C. elegans-Stämme umfassten zwei, die gegenüber RNAi hypersensitiv sind – A1, Lin-15B und RF3 – sowie den standardmäßigen Wildtyp-Stamm N2 und den LIN-36-Stamm, dessen RNAi-Sensitivität der von N2 ähnelt, wie hier gezeigt. Bei Störung der SMA-3- oder SMA-6-Expression zeigten die Tiere eine signifikant geringere Körperlänge als Kontrolltiere, mit Ausnahme von SMA-6-RNAi in Lin-36. Hintergrund in RF3.

Die Körperlängen von jungen Erwachsenen nach RNAi-Behandlung betrugen 84 bis 95 % der alleinigen Vektorbehandlung. Bei einem Lin-15B-Hintergrund betrugen die Körperlängen von jungen Erwachsenen nach RNAi 68 bis 86 % der Kontrolltiere. Allerdings produziert der Lin-15B-Stamm nur wenige Nachkommen.

Dies macht sie für eine großangelegte Untersuchung ungeeignet. Daher wird die Verwendung des RF-Dreistammes für diese Techniken empfohlen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gene identifiziert, die das Wachstum und die Körperegröße mittels RNI-Interferenztechnik regulieren.