Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Schlagfrequenzen frei schwimmender mikroskopischer Organismen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe mikroskopischer Würmer vorbereitet wird. Anschließend wird der optische Aufbau vorbereitet.

Dann wird das Beugungsmuster aufgezeichnet, das durch die lebenden Organismen verursacht wird. Schließlich werden die aufgezeichneten Daten analysiert, um die Schwimmfrequenzen zu bestimmen. Letztendlich dient die Beugungsanalyse dazu, Veränderungen in den Fortbewegungsmustern ungefesselter Würmer aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der traditionellen Mikroskopie besteht darin, dass Schwimmverhalten beobachtet werden kann, während die Art sich frei in einem dreidimensionalen Raum bewegt. Obwohl diese Methode Einblicke in das freie Schwimmen von C. elegans ermöglicht, kann sie auch auf andere durchsichtige, kleine und mikroskopische Organismen angewendet werden, die unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt sind. Um C. elegans für die Videoanalyse vorzubereiten, beginnen Sie damit, mit einem abgeflachten Platindraht 10 bis 20 GR adulte Nematoden auf frisches NGM zu übertragen.

Mit Agar gefüllte Petrischalen, die kleine runde Stellen mit E. coli enthalten. Die Nematoden drei bis fünf Stunden lang Eier legen lassen und anschließend die erwachsenen Tiere entfernen. So entsteht eine kleine, entwicklungsynchronisierte Kultur aus 50 bis 150 Nematoden. Um die Nematoden bis zum frühen Erwachsenenstadium heranzuziehen, die Petrischalen vier bis fünf Tage bei 20 Grad Celsius inkubieren.

Am Tag der Videoanalyse ein Milliliter deionisiertes destilliertes Wasser verwenden, um eine Platte mit jungen adulten Nematoden abzuspülen, um so 50 bis 150 Würmer aus der synchronisierten Kultur zu gewinnen. Die Würmer mithilfe einer Mikrozentrifuge auf den Boden des Röhrchens zentrifugieren oder etwa 15 Minuten lang durch Schwerkraft sedimentieren lassen. Anschließend den Großteil des Wassers vom Röhrchen entfernen und durch ein Milliliter deionisiertes destilliertes Wasser ersetzen, um anhaftende Bakterien von den Nematoden abzuwaschen.

Übertragen Sie mit einer Mikropipette fünf bis 10 Nematoden in Wasser auf eine Quarzküvette. Bauen Sie den optischen Aufbau wie hier gezeigt auf, unter Verwendung eines 543 Nanometer Helium-Neon-Lasers, zweier Aluminiumspiegel mit vorderer Reflexionsoberfläche zur Lenkung des Laserstrahls durch die Küvette, eines Küvettenhalters, eines Projektionsschirms und einer Hochgeschwindigkeitskamera, die in der Lage ist, mit etwa 240 Bildern pro Sekunde zu filmen. Bedecken Sie anschließend die Öffnung der Küvette mit einem Stück Parafilm und drehen Sie sie um, um die Nematoden in der Wassersäule zu vermischen.

Platzieren Sie die Röhre in einem Röhrenhalter, sodass sich die Würmer anfangs nahe dem oberen Ende der Röhre befinden. Lenken Sie mithilfe der Spiegel den Laserstrahl durch die Mitte der Röhre. Da die Nematoden dichter als Wasser sind, sinken sie langsam zum unteren Ende der Röhre, während sie in der Wassersäule schwimmen. Färben Sie auf dem Projektionsbildschirm den Bereich, der dem transmittierten Laserstrahl entspricht, schwarz, um die Streuung zu verringern, wenn der transmittierte Strahl auf den Bildschirm trifft.

Die Streuung des transmittierten Strahls zu eliminieren oder zu reduzieren, verhindert, dass das CCD-Array der Kamera aufgrund des transmittierten Strahls sättigt. Um ein Maß für die Größe des Beugungsmusters aufzuzeichnen, zeichnen Sie eine Linie von etwa fünf Zentimetern Länge auf den Projektionsschirm neben dem Fleck des transmittierten Laserstrahls, ohne das Bild des gebeugten Lichts zu stören. Schalten Sie das Raumlicht aus und nehmen Sie Beugungsbilder auf dem Schirm auf, während die Würmer den Laserstrahl passieren.

Um die Videodaten vorzubereiten, installieren Sie das folgende Videoanalyseprogramm und importieren Sie das Video in das Programm. Legen Sie den Ursprung mithilfe der Software so fest, dass er mit dem transmittierten Laserspot übereinstimmt. Verfolgen Sie die Winkelverschiebung des Beugungsbildes, das von jedem Nematoden erzeugt wird.

Kopieren und fügen Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation ein und addieren Sie 180 Grad oder PI zu allen negativen Winkeln, um einen kontinuierlichen Graphen zu erzeugen. Verwenden Sie die Videoanalyse-Einrichtung, um eine Fotodiode mit einer kleinen Fläche exzentrisch im Beugungsmuster direkt vor dem Projektionsschirm über einen USB-Anschluss anzubringen.

Schließen Sie die Photodiode an das digitale Oszilloskop an, das mit dem Computer verbunden ist. Beobachten Sie die Schlagmuster auf dem Computerschirm. Speichern Sie die Datensätze im ASCII- oder Textformat, um die Daten zu analysieren.

Verwenden Sie ein Video oder das Foto, um die Daten in ein Datenanalyseprogramm zu importieren, das in der Lage ist, Wellenformen anzupassen. Passen Sie mithilfe der Chi-Quadrat-Minimierung eine sinusförmige Kurve an, um die Schlagfrequenz zu bestimmen. Mitteln Sie die Schwimmfrequenzen aus verschiedenen Proben und ermitteln Sie die Varianz.

Für diese Studie wurden die Daten statistisch mit einem einstufigen Inova unter anschließendem Bon Ferran analysiert. Beim multiplen Vergleichstest wird ein P-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant angesehen, um Beugungsmuster zu modellieren. Beginnen Sie damit, mithilfe eines Mikroskops Bilder aufzunehmen, um ein Bild zu analysieren.

Ziehen Sie es in Mathematica hinein. Verwenden Sie den Befehl „binary eyes“, um es in ein Schwarz-Weiß-Bild umzuwandeln. Alternativ verwenden Sie den Befehl „edge detect“, um ein Schwarz-Weiß-Bild zu erzeugen, wobei die beiden nachfolgenden Zahlen die Grobheit der resultierenden Kanten steuern.

Danach mithilfe des Befehls „image data“ das Bild in eine Matrix aus Nullen und Einsen umwandeln. Mit dem Befehl „forer“ die Matrix transformieren, anschließend den Absolutwert der Matrix quadrieren und das resultierende Bild betrachten, welches dem Beugungsmuster des ursprünglichen Bildes entspricht. Zusätzlich die Kontraste des Bildes mithilfe der Logarithmusfunktion skalieren.

Vergleichen Sie abschließend die modellierten Beugungsmuster mit den Beugungsmustern, die von frei schwimmenden Würmern erhalten wurden. In diesem Beispiel wurden Sea Elegance in einer Quarz-Q-Küvette mit einer Breite von einem Zentimeter, einer Dicke von fünf Millimetern und einer Höhe von vier Zentimetern untersucht. Dabei wurde ein einzelner Wurm mittels Videoanalyse erfasst.

Die aus der Videoanalyse gewonnene durchschnittliche Schwimmfrequenz in einem fünf Millimeter dicken Wurm betrug etwa 2,5 Hertz. Ebenso ergab die Erfassung eines einzelnen Wurms mithilfe der Echtzeit-Datenerfassungsmethode und eines digitalen Oszilloskops eine Schwimmfrequenz von etwa 2,7 Hertz. Dieses Verfahren kann für viele Würmer wiederholt werden.

Eine detaillierte Untersuchung frei schwimmender Würmer ergab eine durchschnittliche Schwimmfrequenz von 2,37 Hertz in einem fünf Millimeter breiten Vete. Wie erwartet, ist die Schwimmfrequenz höher als die eines kriechenden Wurms. Mithilfe dieser Beugungsmethode wurde festgestellt, dass die durchschnittliche Schwimmfrequenz einer auf einem Mikroskoppräparat eingeschränkten Sea Elegance dem zuvor veröffentlichten Wert von zwei Hertz entspricht.

Nach dem Video. Die in diesem Video demonstrierte Datenaufbereitung und Modellierung von Beugungsmustern ermöglicht die Modellierung von Schwimm-Beugungsmustern. Mithilfe von Wurmbildern, die mit einem herkömmlichen Mikroskop gewonnen wurden, werden die modellierten Beugungsmuster verwendet, um einen Schwimmzyklus von C. elegans zu simulieren.

Ein erfolgreiche Modellierung zeichnet sich durch physikalisch realistische Schwimmabläufe aus, die mit den Schwimmfrequenzen übereinstimmen. Der Wurm sollte am Ende eines Schwimmzyklus dieselbe Form aufweisen wie zu Beginn des Zyklus. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie für jeden Wurm in weniger als einer Minute durchgeführt werden, wobei die schnelle Fotodiät verwendet und die Schwimmzyklen auf dem Computerbildschirm beobachtet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie frei schwimmende Nematoden beurteilt werden können.