Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp
13. April 2018
Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache Methode zur Erzeugung und Isolierung von zellzyklus-arrestierten Zellen mit komplexen Karyotypen bereitzustellen. Diese Methode kann Antworten auf zentrale Fragen der Aneuploidieforschung geben, etwa zur Interaktion des Immunsystems mit aneuploiden Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Zellpopulation erzeugt, die nur komplexe Karyotypen beherbergt.
Um mit der Synchronisierung von RPE-1 hTERT-Zellen zu beginnen, verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen und geben Sie sie mit acht Millilitern Standard-Wachstumsmedium in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale. Verwenden Sie anschließend ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu bestimmen. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht.
Ersetzen Sie am nächsten Tag das Standard-Wachstumsmedium durch ein Medium, das fünf Millimolare Thymidin enthält. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen an der G1S-Grenze zu synchronisieren. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden dreimal mit PBS.
Geben Sie dann Standard-Wachstumsmedium zu den gewaschenen Zellen und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie zuerst die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 500 nanomolare Mps1-Inhibitor-Reversin enthält.
12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag dreimal mit PBS. Fügen Sie dann Standard-Wachstumsmedium hinzu und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator.
Etwa 72 Stunden nach der ersten aberranten Mitose waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazol enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Am nächsten Tag aspirieren Sie das Nocodazol-Medium. Geben Sie dann drei Milliliter PBS in die Schüssel und klopfen Sie auf die Seite des Tellers, um die mitotischen Zellen abzuschütteln. Drehen Sie die Platte zwischen jedem Klopfen, um eine gleichmäßige Entnahme der mitotischen Zellen zu ermöglichen.
Nach dem ersten Abschütteln die am Deckel und am Rand der Platte anhaftende Flüssigkeit ansaugen. Überprüfen Sie dann die Platte unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern PBS.
Als nächstes fügen Sie Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazole enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dem abschließenden Schütteln fügst Du 10 Milliliter Standard-Wachstumsmedium hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen 12 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Assays durchführen. Die auf der Platte verbleibenden Zellen werden als mit komplexen Karyotyp- oder ArCK-Zellen arrestiert bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von ArCK-Zellen und es werden mehrere für ArCK-Zellen spezifische Merkmale analysiert, um ihre Isolierung zu bestätigen.
ArCK-Zellen zeigen in der Immunoblot-Analyse erhöhte Spiegel der Zellzyklus-Inhibitoren p53, p21 und p16, während euploide und aneuploide Zykluszellen dies nicht tun. Darüber hinaus sind ArCK-Zellen positiv für die Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase, die blau-grün färbt, während euploide Kontrollzellen dies nicht tun. Segmentierungsdiagramme zeigen, dass ArCK-Zellen aneuploid sind und durch mehrfache, zufällige Chromosomengewinne und Chromosomenverluste gekennzeichnet sind.
Segmentierungsdiagramme zeigen die Kopienzahl einzelner Zellen von Chromosom eins bis X relativ zu einer euploiden Referenz-Logarithmus-Skala von zwei. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie bei jedem Shake-off alle mitotischen Zellen entfernen. Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Zytokin-Assays durchgeführt werden.
Diese Assays werden bei der Beantwortung weiterer Fragen helfen, wie z.B. der Fähigkeit von ArCK-Zellen, mit den Zellen des Immunsystems zu interagieren. Vergessen Sie nicht, dass Nocodazol gefährlich ist. Bei der Verwendung dieses Reagenzes sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden.
Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um ArCK-Zellen effizient in vitro zu isolieren. Dieser Eingriff kann bei ordnungsgemäßer Durchführung in sieben Tagen durchgeführt werden.
Übersicht
Diese Studie stellt eine einfache Methode zur Isolierung aneuploider Zellen mit komplexen Karyotypen vor, die im Zellzyklus arretiert sind. Das Verfahren zielt darauf ab, das Verständnis von Aneuploidie und ihren Auswirkungen auf das zelluläre Verhalten sowie auf immunologische Interaktionen zu vertiefen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Genetik
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Aneuploidie ist mit genomischer Instabilität assoziiert.
- Zellen mit komplexen Karyotypen hören oft auf, sich zu teilen.
- Das Verständnis dieser Zellen kann Einblicke in Krebs und andere Erkrankungen liefern.
- Die Isolierung dieser Zellen kann die weitere Erforschung ihrer Eigenschaften erleichtern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Erzeugung und Isolierung von Zellen mit Zellzyklusarrest.
- Untersuchung der Eigenschaften aneuploider Zellen.
- Untersuchung der Interaktion zwischen aneuploiden Zellen und dem Immunsystem.
Verwendete Methoden
- Synchronisierung von RPE-1 hTERT-Zellen mittels Thymidin und Nocodazol.
- Zellschütteltechnik zur Isolierung von mitotischen Zellen.
- Immunoblot-Analyse zur Beurteilung von Zellzyklusinhibitoren.
- Seniorenassoziierte Beta-Galactosidase-Färbung zur Identifizierung von ArCK-Zellen.
Hauptergebnisse
- ArCK-Zellen weisen erhöhte Spiegel von Zellzyklusinhibitoren auf.
- Diese Zellen sind positiv für seneszenzassoziierte Marker.
- Segmentierungsdiagramme bestätigen Aneuploidie in isolierten Zellen.
- Die Methode ermöglicht die effektive Isolierung von Zellen mit komplexen Karyotypen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um aneuploide Zellen zu untersuchen.
- Isolierte ArCK-Zellen können für weitere Forschungen zu immunologischen Wechselwirkungen verwendet werden.
- Eine ordnungsgemäße Durchführung der Methode kann innerhalb einer Woche Ergebnisse liefern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von Zellen mit komplexen Karyotypen, die im Zellzyklus arrestiert sind, ermöglicht die mechanistische Absicherung aneuploidiegetriebener Phänotypen in der Entdeckungsforschung. Dieser Ansatz unterstützt die Target-Validierung, indem er ein reproduzierbares System bereitstellt, um chromosomale Instabilität und deren Auswirkungen auf zelluläre Seneszenz, Entzündung und Immunwechselwirkungen zu untersuchen. Die Abhängigkeit der Methode von Standard-Techniken der Zellkultur erhöht die Skalierbarkeit und fördert die Übernahme in frühen Entwicklungsphasen von F&E-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die eine Verbindung zwischen Aneuploidie und genomischer Instabilität sowie proinflammatorischen Phänotypen herstellen.
- Operationaler Wert: Bietet einen standardisierten, kostengünstigen Arbeitsablauf zur Erzeugung von ArCK-Zellen unter Verwendung der Synchronisation mit Thymidin, Reversin und Nocodazol.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt eine definierte Zellpopulation mit komplexen Karyotypen zur quantitativen Analyse von Seneszenzmarkern und Zytokinausschüttung.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch konsistente Isolierung arrestierter Zellen mittels Schütteln und Behandlung mit Nocodazol.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Interaktionen aneuploider Zellen mit Immunzellen und unterstützt die Bewertung immunmodulatorischer Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Ermöglicht funktionelle Nachweisverfahren wie die Zytokine-Profilierung und die beta-Galactosidase-Färbung zur Detektion seneszenter Zellen, um phänotypische Ergebnisse zu validieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung zum Ziel bis hin zum phänotypischen Screening ein, insbesondere für Mechanismen, die chromosomale Instabilität und Stressantwortwege beinhalten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Entrisikung, indem Zellen mit definierter Karyotypkomplexität isoliert werden, um kausale Zusammenhänge zwischen Aneuploidie und zellulären Phänotypen aufzuklären.
- Screening: Ermöglicht die reproduzierbare Herstellung von ArCK-Zellen zur Analyse mit hohem Informationsgehalt bezüglich Zellzyklusinhibitoren und sekretorischer Profile.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse, einschließlich immunblotbasierter Nachweise von p53, p21, p16 sowie Segmentierungsdiagrammen zur Einzelzell-Kopierzahlvariation.
- Translationale Forschung: Knüpft an Untersuchungen zu Immuninteraktionen an und unterstützt die Erforschung von Biomarkern in seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotypen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Verwendet leicht verfügbare Reagenzien und Standardkulturausstattung, wodurch eine Anpassung an verschiedene Labore ohne spezialisierte Infrastruktur möglich ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten in der Aneuploidieforschung, indem ein definiertes Arrestmodell mit komplexen Karyotypen bereitgestellt wird.
- Operationaler Wert: Bietet ein Sieben-Tage-Protokoll mit hoher Spezifität für ArCK-Zellen und verbessert Durchsatz und Reproduzierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine frühe Beurteilung aneuploidiegetriebener biologischer Risiken in Zielwegen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen, die mit chromosomaler Instabilität und Zellalterung assoziiert sind.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellsynchronisierungstechniken und Mitose-Shake-off-Verfahren.
- Setzt den Zugang zu Standard-Zellkulturgehäusen, Hämozytometern und Fluoreszenz- oder Hellfeldmikroskopie zur Validierung voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Nocodazol-Behandlungs- und Waschschritten, um eine vollständige Entfernung von mitotischen Zellen in allen Wiederholungen sicherzustellen.
- Kann bei Anpassung an andere Zelllinien eine Optimierung der Konzentrationen und Inkubationszeiten von Thymidin, Reversin und Nocodazol erfordern.
- Auf In-vitro-Modelle beschränkt; die Anwendbarkeit an primärem Gewebe oder in vivo wird im Quellmaterial nicht behandelt.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
