Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe
9. Juni 2020
Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.
Die Lasermikrodissektion ermöglicht die transkriptomische Analyse von räumlich definierten Regionen innerhalb der Nierengewebeproben. Dies ermöglicht uns die einzigartige Möglichkeit, auch nach krankheitsinduzierten Veränderungen interessante Strukturen zu identifizieren. Die Hauptvorteile dieser Methodik sind ihre Komplementarität zu anderen Omics-Technologien, wie z. B. der Einzelzell-RNA-Sequenzierung.
Es ermöglicht eine bemerkenswerte Gewebeökonomie und ermöglicht sogar den Nachweis von schwach exprimierten Transkripten. Schneiden Sie die Probe nach der Entnahme der Gewebeprobe mit einem auf minus 20 Grad Celsius eingestellten Kryostaten auf eine Dicke von 12 Mikrometern und fixieren Sie die Probe mit dem Objektträgeradapter auf einem speziellen Laser-Mikrodissektionsobjektträger. Mischen Sie innerhalb von 10 Tagen nach der Kryosektion 89,2 Mikroliter RNase-freies 10%BSA in PBS mit vier Mikrolitern FITC-Phalloidin, 1,5 Mikrolitern DAPI, zwei Mikrolitern des Antikörpers von Interesse, der direkt an Alexa Fluor 546 konjugiert ist, und 3,3 Mikroliter RNase-Inhibitor.
Waschen Sie die Rutsche eine Minute lang bei minus 20 Grad Celsius 100% Aceton und legen Sie die Rutsche in eine Feuchtigkeitskammer. Waschen Sie die Oberseite der Folie zweimal 30 Sekunden lang pro Waschgang mit frischem RNase-freiem PBS, gefolgt von zwei 30-Sekunden-Wäschen mit 10 % BSA in RNase-freiem PBS. Behandeln Sie die Probe nach dem letzten Waschen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie sie zwei weitere Male mit 10 % BSA in RNase-freiem PBS waschen.
Nach dem zweiten Waschen trocknen Sie den Objektträger fünf Minuten lang in einer Gewebekulturhaube an der Luft, bevor Sie ihn auf die Lasermikrodissektions-Schneidplattform laden. Installieren Sie autoklavierte 500-Mikroliter-Mikrozentrifugen-Sammelröhrchen, die für PCR-Arbeiten geeignet sind und 50 Mikroliter Extraktionspuffer aus einem RNA-Isolationskit enthalten, auf dem Gerät. Identifizieren Sie nach dem Laden die interessierenden Bereiche innerhalb der Probe anhand von Färbung, Morphologie und Standort.
Verwenden Sie Immunfluoreszenz, um mindestens 500.000 Mikrometer große quadratische Segmente zu umreißen. Initiieren Sie dann die Lasermikrodissektion, um die Region mit einer Laserleistung von mehr als 40 herauszuschneiden. Verschließen Sie nach Abschluss des Lasermikrodissektionsprozesses die Sammelröhrchen der Mikrozentrifuge und schnippen Sie kräftig mit den Röhrchen, um sicherzustellen, dass der Inhalt von den Kappen zum Boden der Röhrchen gelangt.
Nach der Zentrifugation inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang in einem 42 Grad heißen Wasserbad, bevor Sie die Röhrchen erneut zentrifugieren. Anschließend werden die Überstände aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in neue 500-Mikroliter-Röhrchen umgefüllt. Die Identifizierung von tubulären Untersegmenten in der Niere erfolgt durch Antikörperfärbung einzigartiger tubulärer Marker zusätzlich zur Zellmorphologie und strukturellen Orientierungspunkte.
Die Fluoreszenzmarkierung in Verbindung mit morphologischen Gewebemerkmalen und der räumlichen Positionierung der Bildstrukturen ermöglicht die Visualisierung von Nierenuntersegmenten mit einem hohen Maß an Sicherheit. In dieser repräsentativen Downstream-Sequenzierungsanalyse lag die Erfolgsrate bei der Einhaltung der minimalen Dissektionsflächeneingabe bei mehr als 90 %, was zu einer hohen Gesamtmenge an mRNA führte, die für den Gennachweis zur Verfügung stand. In dieser Analyse erreichten 100 % der Proben die minimale Nachweisschwelle von mindestens 10.000 Genen.
Nach der Lasermikrodissektion kann die Anreicherungsanalyse der Genexpression bekannter Marker mit denen aus anderen Kompartimenten verglichen werden. In dieser Analyse wurde ein Marker für jedes Untersegment durch Lasermikrodissektion mittels regionaler Transkriptomik identifiziert, die auch eine spezifische immunhistochemische Färbung des entsprechenden Nephron-Untersegments ergab. Es ist wichtig zu beachten, dass die Lasermikrodissektion stark auf das Fachwissen des Benutzers angewiesen ist, um die zu präparierenden Strukturen von Interesse genau zu identifizieren.
Diese Technik ermöglicht die Untersuchung spezifischer regionaler Genexpressionssignaturen, die zur Beurteilung potenzieller Signalwege verwendet werden können, die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind, sowie der Biologie von gesundem Gewebe.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Laser-Mikrodissektion spezifischer Teilabschnitte in menschlichem Nierengewebe vor, einschließlich des Glomerulus und des proximalen Tubulus. Die isolierte RNA aus diesen Kompartimenten ermöglicht eine transkriptomische Analyse, um Veränderungen in den Genexpressionsmustern zu erkennen, die mit verschiedenen Nierenstrukturen assoziiert sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Transkriptomische Analyse
- Nierenbiologie
- Untersuchung des Krankheitsverlaufs
Hintergrund
- Bedeutung der Untersuchung von Nieren-Teilstücken
- Herausforderungen bei der Analyse räumlich definierter Strukturen nach Krankheiten
- Ergänzung durch andere Omics-Technologien
Verwendete Methoden
- Laser-Mikrodissektion
- Menschliche Nierengewebeproben
- RNA-Isolierung und Sequenzierung
Hauptergebnisse
- Hohe Erfolgsrate bei der Dissektion und RNA-Gewinnung
- Identifizierung von Genexpressionsmarkern für Nieren-Teilsegmente
- Belegte potenzielle Signalwege im Zusammenhang mit Krankheitsverlauf
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll demonstriert eine effektive Methode zur Untersuchung der regionalen Genexpression in der Niere.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Nierenbiologie und möglicher Krankheitsmechanismen bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels Laser-Mikrodissektion ist eine räumlich aufgelöste transkriptomische Profilierung von menschlichem Nierengewebe möglich, wodurch eine entscheidende Lücke in der Entdeckungsbiologie geschlossen wird, da methodenbasierte Dissoziationen den anatomischen Kontext verlieren. Dieser Ansatz unterstützt die Target-Validierung, indem Genexpressionsmuster mit definierten Nephron-Teilabschnitten verknüpft werden, und verbessert so die mechanistische Entrisikung in Modellen der Nierenerkrankung. Die Methode liefert eine vorhersagebasierte Sicherheit für die Untersuchung von Signalwegen und die Priorisierung von Portfolioansätzen in frühen Entdeckungsarbeitsabläufen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Zuordnung von Genexpression zu anatomisch definierten Nierenkompartimenten.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch räumlich verankerte transkriptomische Signaturmuster, die den Gewebekontext bewahren.
- Prädiktiver Wert: Erhöht die Zielkonfidenz, indem die korrelative regionale Markerexpression mit der funktionalen Identität von Teilabschnitten verknüpft wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Omics-Workflows vor, indem RNA mit hoher Integrität aus mikrodissezierten Bereichen isoliert wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Assays durch QC-Parameter, die die Eignung der Probe und die Erfolgsraten der Dissektion bewerten.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht eine zuverlässige Wirkstoffbewertung, indem quantitative, räumlich aufgelöste transkriptomische Daten für Screening-Kampagnen bereitgestellt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Validierung durch die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme unter Verwendung menschlicher Nierenteilsegmente.
- Biomarker-Ausrichtung: Unterstützt die translationale Entwicklung von Biomarkern, indem sie kompartimentsspezifische Genexpressionsprofile identifiziert, die im Gewebe nachweisbar sind.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Leitet präklinische Entscheidungen ein, indem sie die Aktivität von Signalwegen in anatomisch präzise betroffenen Krankheitsregionen aufzeigt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Laser-Mikrodissektion ist in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Leitstrukturidentifizierung eingebettet und ermöglicht eine ortsauflösende molekulare Profilierung, die bildgebende Verfahren und Omics miteinander verbindet.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem die Genexpression mit strukturellen Markern im Nierengewebe verknüpft wird.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch Dissektionen mit hoher Erfolgsrate (>90 %) und ausreichende RNA-Ausbeute für Sequenzierungsanwendungen.
- Analytik: Bietet quantitative Messungen der abhängigen Variablen (Nachweisgrenzen für Gene ≥10.000 Gene), die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbessert die präklinische Kontinuität, indem der räumliche Kontext erhalten bleibt, der bei auf Dissoziation basierenden Methoden verlorengeht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Fähigkeit über verschiedene Gewebetypen hinweg durch den Austausch von Antikörpemarkern und unterstützt die flächendeckende Einführung auf Plattformebene.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Uneindeutigkeiten bei der Nieren-Target-Validierung reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Workflow-Parameter und QC-Prüfpunkte.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine risikoadjustierte Priorisierung auf Grundlage der biologischen Gegebenheiten spezifischer Nieren-Subsegmente ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die Kapital-Effizienz durch frühzeitige Absicherung von Nieren-Targets mithilfe räumlich aufgelöster Nachweise.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Immunfluoreszenz-Färbung und der morphologischen Identifizierung renaler Teilsegmente.
- Setzt Laser-Mikrodissektionsplattformen und RNA-Isolationskits voraus, die mit Proben geringer Menge kompatibel sind.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg hinsichtlich Färbeprotokollen, Dissektions-Schwellenwerten und Qualitätskontrollkriterien.
- Die Übertragung auf verschiedene Modelle erfordert die Validierung von Antikörpemarkern und strukturellen Orientierungspunkten in den Zielgeweben.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die vom Anwender abhängige Genauigkeit bei der Identifizierung von Regionen sowie die Aufrechterhaltung der RNA-Integrität während der Probenvorbereitung.
