Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung
11. Februar 2008
Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.
Hallo, ich bin Kevin won. Ich bin Master of Engineering-Student im Biofluids-Labor der Cornell University. Und heute werde ich darüber sprechen, wie man ein auf Agros basierendes mikrofluidisches Gerät verwendet, um die Wirkung von EGF (epidermal growth factor) auf murine neurale Stammzellen zu untersuchen.
Die Vorrichtung besteht im Wesentlichen aus drei mikrofluidischen Kanälen, von denen jeder 150 Mikrometer breit ist. EGF wird in einen der Seitenkanäle gepumpt, und Puffer wird in den anderen Seitenkanal gepumpt. Dadurch wird im zentralen Kanal im Wesentlichen ein statischer linearer chemischer Gradient erzeugt.
Da EGF leicht durch das Agarose-Gel diffundiert, werden die neuronalen Stammzellen in den mittleren Kanal eingebracht, und die Wanderung der Zellen wird mithilfe eines Mikroskops verfolgt. Die Vorrichtungen bestehen im Wesentlichen aus einer Plexiglas-Deckschicht, die alle Ein- und Auslässe für den Anschluss an Schläuche enthält. Darunter befindet sich eine Agarose-Gel-Membran, in die vier strukturierte Vorrichtungen eingearbeitet sind.
Dies ist von einem PDMS-Abstandshalter umgeben, der gewährleistet, dass wir über das gesamte Gerät hinweg eine konstante Dicke haben. Das PDMS und das Gel werden auf einem Objektträger montiert, der mit ect beschichtet ist. Dies hilft den Zellen, am Objektträger zu haften.
Zusätzlich dient die Edelstahlplatte als Träger zur Montage des gesamten Geräts, und wir befestigen das Gerät mithilfe von Schrauben im Sandwich-Verfahren. Die Wildtyp-Zelllinie wurde mit einem Retrovirus-Vektor transfiziert, um den Wildtyp-EGF-Rezeptor überzuexprimieren, und die Delta-Zelllinie wurde mit einer mutierten Version des EGF-Rezeptors transfiziert, die eine konstitutive Aktivität unabhängig vom EGF-Liganden ermöglicht. Gut, ich werde nun mit der Erklärung des Montageprozesses unseres mikrofluidischen Geräts beginnen.
Zunächst platzierte ich den PDMS-Abstandshalter um die Reliefstrukturen der siliziumbasierten Mikrokanäle unserer Master. Nun werde ich 0,3 Gramm Agarose abwiegen. Anschließend werde ich 10 ml CO2-unabhängiges Medium aufnehmen und zu der Agarose hinzufügen.
Und ich werde auf- und abpipettieren, um das Agros-Pulver mit dem CO2-unabhängigen Medium zu mischen. Jetzt sind wir bereit für die Mikrowelle. Wie Sie jetzt sehen können, ist das Agros bereits verflüssigt, aber es sind noch einige Körnchen vorhanden.
Ich werde versuchen, dies zu wirbeln, um das Granulat aufzulösen und die Luftblasen zu entfernen. Ich gieße nun das geschmolzene Agarose-Gel auf die Reliefstrukturen des Silikon-Abdrucks und nehme jetzt einen sterilen Objektträger, den ich über den PDMS-Abstandshalter lege. Dabei platziere ich ihn in einem Winkel, um möglichst viele Luftblasen aus dem Agarose-Gel herauszudrücken.
Und ich habe Druck ausgeübt und werde weiterhin Druck ausüben, bis die Agros-Schale erstarrt ist. Nach einer bis zwei Minuten ist sie fest geworden. Nun werde ich das überschüssige Agros vom Objektträger entfernen.
Der nächste Schritt besteht darin, die Objektträger vorsichtig abzuziehen; diese Objektträger können entsorgt werden. Nun werde ich versuchen, das Muster aros vorsichtig auf einen Objektträger zu übertragen, den ich zuvor mit Fibronectin beschichtet habe. Im Grunde verwende ich dieses sterile Kunststoffblatt, um mir beim Anheben des Musters aros mit dem PDMM-MS-Abstandshalter zu helfen, und ich werde das Muster aros mit den Kanälen nach unten in Richtung des Objektträgers übertragen.
Nun, da dies fest auf dem Objektträger sitzt, stanze ich Löcher in die einzelnen Reservoire, damit der Kunststoffverteiler Zugang zu den Kanälen hat. Dazu verwende ich einen kleinen metallenen Locher. Nun haben wir das Stanzen der Löcher in das Gerät abgeschlossen.
Ich gebe 500 Mikroliter CO2-unabhängiges Medium hinzu, um die Austrocknung der Mikrokanäle zu verhindern, und lasse es nun eine bis zwei Minuten lang stehen. Gut, nach einer bis zwei Minuten werde ich versuchen, das überschüssige Medium abzulassen, und jetzt richte ich die in das Pattern Agros gestanzten Löcher mit den Einlass- und Auslassöffnungen des Plexiglas-Manifolds aus. Sobald die Löcher ausgerichtet sind, drücke ich fest, um eine gute Abdichtung zu erzielen.
Jetzt lege ich den Plexiglasverteiler über die Edelstahlhalterungen und werde das Gerät vorsichtig mit Schrauben zusammensetzen. Ich achte sehr darauf, die Schrauben nicht übermäßig festzuziehen, da dies die Kanäle zusammendrücken würde, und setze die Schrauben im Uhrzeigersinn ein, um zu verhindern, dass sich das innenliegende Agros-Gel verschiebt. Ich werde ein Milliliter Medium aufziehen und diese Spritze verwenden, um das Gerät zu testen.
Und wie Sie sehen können, injiziere ich Flüssigkeit in jeden Mikrokanal und prüfe, ob Flüssigkeit an jedem Auslass austritt. Im Moment habe ich das zusammengebaute Gerät in die Umweltkammer des Mikroskops eingelegt. Diese wird bei 37 Grad Celsius gehalten, sodass das Gerät erwärmt wird und bereit ist, sobald wir die Zellen einsäen müssen.
Und wie Sie sehen können, habe ich bereits die Schläuche der Parasol-Pumpe durch die Versuchsanordnung geführt. Derzeit spüle ich die Schläuche mit PBS, um unsere Experimente vorzubereiten. Nun werden wir die Schläuche einrichten.
Ich werde den Schlauch der Parasol-Pumpe durch die Deckel führen, in die bereits Löcher gestanzt wurden. Jeder Schlauch weist eine bestimmte Anzahl von Kerben auf, anhand derer ich Einlass und Auslass des Schlauches identifizieren kann. Der Schlauch mit vier Kerben erhält also 10 Nanogramm pro Milliliter.
Die EGF-Lösung wird nun das Tubing an das Gerät anschließen. Ich werde es an jedes Gerät entsprechend der Anzahl seiner Kerben anschließen. Dies entspricht der Lösung, die es aufnimmt.
Und nun befestige ich das Auslassrohr. Wir verwenden ein durchsichtiges Tigon-Rohr, um sicherzustellen, dass das Medium tatsächlich durch das Auslassrohr fließt und keine Verstopfungen im Kanal vorliegen. Nun werde ich die Parasol-Pumpen starten.
Jetzt beginne ich mit dem Verfahren, die Zellen in den mittleren Kanal zu säen. Zunächst entferne ich das überschüssige Medium aus dem Sensor-Kanal. Nun werde ich die Zellen sehen.
Die Zellen befinden sich bereits in Suspension in CO2-unabhängigem Medium. Und ich habe 60 in den Einlass des mittleren Kanals und 20 µL in den Auslass pipettiert. Hoffentlich sedimentieren die Zellen durch den gravitationsgetriebenen Fluss.
Und ich werde dieses Verfahren für die beiden anderen empfindlichen Kanäle wiederholen und anschließend unter dem Mikroskop beobachten, ob die Zellansiedlung erfolgreich war. Die Zellen haben sich nun an der Glasoberfläche festgesetzt und werden in wenigen Minuten beginnen, sich auszubreiten und ihre charakteristische Morphologie anzunehmen. Heute haben wir somit den Zusammenbau des eigentlichen Geräts, die Vorbereitung der Reagenzien sowie die Mikroskopietechniken behandelt, die ich zur Aufnahme der Zellmigration innerhalb des Geräts verwende.
Zusammenfassend hoffen wir, dass dieses Gerät eine weitaus umfassendere Anwendung, insbesondere im klinischen Umfeld, finden wird. Die Abbildung eins ist horizontal ausgerichtet. Sie zeigt die Bewegungsbahnen der C17.2-Zellen und steigende EGF-Konzentrationen vertikal.
Es zeigt die Trajektorien der verschiedenen Stämme der C17.2-Zellen, die wir in unseren Experimenten mit derselben EGF-Konzentration verwendet haben. Die Daten der ursprünglichen Zellen zeigen, dass bei einem EGF-Konzentrationsgradienten von 10 Nanogramm pro Milliliter ein Maximum der Motilität erreicht wird, was darauf hindeutet, dass die Rezeptoren bei höherer EGF-Konzentration mit Ligand gesättigt sind. Die Daten des Wildtyps zeigen hingegen eine Zunahme der Motilität bei einer Konzentration von hundert Nanogramm pro Milliliter EGF.
Dies zeigt, dass die Rezeptoren bei höheren EGF-Konzentrationen nicht gesättigt werden. Dies ist sinnvoll, da sie so konstruiert wurden, dass sie den EGF-Rezeptor überexprimieren. Schließlich weisen die Daten der Delta-Zelllinie darauf hin, dass die Beweglichkeit der Zellen nahezu unabhängig von der EGF-Konzentration ist.
Dies ist ebenfalls zu erwarten, da die mutierten EGF-Rezeptoren so konstruiert wurden, dass sie unabhängig von der Anwesenheit von EGF aktiviert werden.
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Übersicht
Diese Studie zeigt, dass die Überexpression von epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Motilität von neuronalen Stammzellen (NSCs) mithilfe einer neuartigen auf Agarosegel basierenden mikrofluidischen Vorrichtung erhöht. Diese Technologie ist auf andere Säugetierzellsysteme übertragbar, bei denen Zellquellen knapp sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mikrofluidik
Hintergrund
- Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) beeinflusst das Zellverhalten.
- Neurale Stammzellen (NSCs) sind entscheidend für die neuronale Regeneration.
- Mikrofluidische Vorrichtungen ermöglichen eine präzise Kontrolle der zellulären Umgebung.
- Das Verständnis der NSC-Motilität kann der regenerativen Medizin zugutekommen.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wirkung von EGF auf die Motilität von NSC.
- Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung zellulärer Reaktionen.
- Gewinnung von Erkenntnissen zum Verhalten von NSC unter kontrollierten Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Entwicklung einer auf Agarosegel basierenden mikrofluidischen Vorrichtung.
- Erzeugung eines statischen linearen chemischen Gradienten von EGF.
- Beobachtung der NSC-Motilität als Reaktion auf EGF-Exposition.
- Nutzung mikrofluidischer Kanäle zur präzisen Flüssigkeitskontrolle.
Hauptergebnisse
- Die Überexpression von EGFR erhöht die Motilität von NSC signifikant.
- Die mikrofluidische Vorrichtung erzeugt effektiv chemische Gradienten.
- Die Ergebnisse deuten auf mögliche Anwendungen in regenerativen Therapien hin.
- Die Befunde können auf humane neurale Stammzellen übertragen werden.
Schlussfolgerungen
- EGF spielt eine entscheidende Rolle bei der NSC-Motilität.
- Das entwickelte Gerät ist ein wertvolles Werkzeug für zelluläre Untersuchungen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf andere Zelltypen und Bedingungen ausgeweitet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Motilität neuraler Stammzellen dient als prädiktiver Biomarker für das Tumorbildungspotential und Entwicklungserkrankungen, weshalb ihre quantitative Bewertung bei der Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium entscheidend ist. Die auf Agarosegel basierende mikrofluidische Plattform ermöglicht reproduzierbare, gradientengesteuerte Motilitätsassays, die eine mechanistische Risikominderung bei EGFR-Signalwegsmodulatoren unterstützen. Dieser Ansatz erhöht die Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Leitsubstanzen, indem er eine Überexpression von Rezeptoren mit funktionellen phänotypischen Ausgaben in einem krankheitsrelevanten System verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der EGFR-abhängigen Motilität als funktionellen Endpunkt für die Zielstrukturenbindung in neuronalen Stammzellen.
- Operationaler Wert: Bietet ein kontrolliertes Mikromilieu, um die Effekte der EGFR-Signalübertragung von störenden Variablen in Motilitätsassays zu isolieren.
- Predictiver Wert: Unterstützt das phänotypische Screening von EGFR-Modulatoren durch Quantifizierung von Motilitätsänderungen unter definierten chemischen Gradienten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantitative, optische Beweglichkeitsmessungen, die für die Analyse mit hohem Informationsgehalt und die Wirkstoff-Screening geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Die Herstellung von Agarosegelen gewährleistet konsistente Kanalgeometrie und Diffusionseigenschaften über alle Wiederholungen hinweg.
- Skalierbarkeit: Die Mustergestaltung mehrerer Geräte in einer einzigen Gelmembran ermöglicht die parallele Prüfung mehrerer Bedingungen oder Zelllinien.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verbindet die Motilität von NSC mit der Bewertung tumorigener Faktoren und unterstützt präklinische Modelle der Invasion von bösartigen Stammzellen des Gehirns.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Klärt, ob eine Überexpression von EGFR eine ligandenunabhängige Motilität verursacht, und liefert damit Grundlagen für die Auswahl von Zielstrukturen für inhibitorische Strategien.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht den Vergleich von Wildtyp-, überexprimierten und konstitutiv aktiven EGFR-Varianten, um klinische Ansprechmodelle vorherzusagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Gerät fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten ein und liefert beweglichkeitsbasierte phänotypische Daten, die vor der präklinischen Investition über Go/No-Go-Entscheidungen informieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Rolle des EGFR bei der NSC-Motilität durch präzise Gradientenkontrolle und Echtzeit-Bildgebung.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Motilitätsdaten, die den Vergleich von EGFR-modulierenden Substanzen oder genetischen Varianten ermöglichen.
- Analysen: Erzeugt auf Bewegungsbahnen basierende Metriken, die den statistischen Vergleich der Motilität unter verschiedenen Bedingungen und Zelllinien erleichtern.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Motilitätsbefunde mit pathophysiologischer Relevanz in Modellen der neuralen Entwicklung und bei Gehirntumoren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Agarose-Gel-Plattform ist an andere Säugetierzelltypen anpassbar und unterstützt eine standardisierte Anwendung über verschiedene Projekte hinweg bei motilitätsbasierten Assays.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unschärfe in der EGFR-Signalübertragung, indem der Rezeptorzustand mit funktionellen Motilitätsphänotypen verknüpft wird.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit des Assays sicher durch standardisierte Gelelektrophorese und Gradientenerzeugung mittels Seitenkanal-Perfusion.
- Strategischer Wert: Verbessert die Priorisierung von Zielstrukturen, indem funktionelle Validierung über Bindungs- oder Expressionsassays hinaus bereitgestellt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von EGFR-gerichteten Kandidaten basierend auf motilitätsgetriebener phänotypischer Entschärfung von Risiken.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Mikrofluidik-Assemblierung, im Umgang mit Agarosegelen und in der Live-Cell-Abbildung unter kontrollierter Perfusion.
- Setzt den Zugang zu Perfusionspumpen, Umweltkammern und invertierten Mikroskopen für die zeitaufgelöste Verfolgung der Zellmotilität voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Zellsäuredichte und der Geleddicke, um reproduzierbare Diffusionsgradienten und Adhäsion zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Zelltypen, basierend auf deren Adhäsionseigenschaften und Motilitätsverhalten auf fibronectinbeschichteten Oberflächen.
- Ist durch die optische Zugänglichkeit der Gelmatrix und mögliche Autofluoreszenz, die bestimmte fluoreszenzbasierte Messungen beeinträchtigen kann, eingeschränkt.
