In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Stammzellen besitzen das bemerkenswerte Potenzial, sich in viele verschiedene Zelltypen des Körpers zu entwickeln. Sie dienen gewissermaßen als Reparatursystem für den Körper. Theoretisch können sie sich unbegrenzt teilen, um andere Zellen nachzubilden.

Wenn sich eine Stammzelle teilt, hat jede neue Zelle das Potenzial, entweder eine Stammzelle zu bleiben oder sich in einen anderen Zelltyp mit einer spezialisierteren Funktion zu verwandeln. Dieser aussichtsreiche Bereich der Wissenschaft führt dazu, dass Wissenschaftler die Möglichkeit zellbasierter Therapien zur Behandlung von Krankheiten in vitro untersuchen. Die Differenzierung embryonaler Stammzellen erfolgt, wenn die Zellen in einer Suspensionkultur aggregieren dürfen.

Bei Abwesenheit von embryonalen Mausfibroblasten-Fütterungszellen und Leukämie-Inhibitionsfaktor werden diese Zellaggregate Embryoidkörper genannt. Die Hänge-Tropfen-Methode ist ein wirksames Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Embryoidkörper in vitro. Hallo, ich bin Sha Juan aus der Abteilung für Kardiovaskuläre Medizin an der Stanford University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur individuellen Differenzierung von embryonalen Stammzellen zu Embryoidkörpern mithilfe der Hanging-Drop-Methode. Diese Methode verwenden wir typischerweise, um embryonale Stammzellen in Kardiomyozyten zu differenzieren. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus embryonalen Stammzellen, Erzeugung von Hanging-Drop-Kulturen, Überführung der Hanging-Drop-Kulturen in Ultra-Low-Attachment-Platten und das Ausplattieren der Embryoidkörper auf Gelatine-beschichteten Platten.

Okay, beginnen wir. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Einzelzell-Suspension von embryonalen Stammzellen herzustellen. Da wir unsere undifferenzierten embryonalen Stammzellen kultivieren, indem wir sie auf embryonalen Mausfibroblasten wachsen lassen, müssen wir die Zellen ablösen und von den Fibroblasten trennen.

Dazu versetzen wir die Zellen mithilfe von Standardverfahren mit Trypsin. Sobald die Trypsinbehandlung abgeschlossen ist, geben wir Maus-Embryonalstammzell-Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Anschließend überführen wir die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Reaktionsgefäß.

Zerstören Sie dann die Zellkolonien, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, wobei Sie die Pipettenspitze gegen den Boden des Röhrchens drücken, bis eine feine Zellsuspension ohne sichtbare Zellklumpen entsteht. Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei eintausend U/min für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand per Aspiration und resuspendieren die Zellen in 10 ml Mouse ES Cell Medium.

Überführen Sie die Zellsuspension in einen mit 0,1 % Gelatine vorbeschichteten T-75-Flasche und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad mit 5 % CO2. Nach einer Stunde haben sich die Fibroblasten an der Platte angeheftet, während die Stammzellen im Medium verbleiben. Pipettieren Sie das Medium auf, um die Stammzellen zu sammeln.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei tausend U/min für fünf Minuten und aspirieren Sie das Medium ab. Geben Sie anschließend weitere 10 ml Differenzierungsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch mehrfaches Pipettieren, bis eine feine Zellsuspension vorliegt. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers.

Nun können wir die Zellsuspension mit der Hängetropfen-Methode kultivieren. Um die Hängetropfen-Kultur zu beginnen, verdünnen Sie die Stammzellsuspension mit Differenzierungsmedium auf eine Konzentration von 500 Zellen pro 20 Mikroliter. Danach kehren Sie den Deckel einer 150-Millimeter-Zellkulturplatte um.

Anschießend pipettieren Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension auf die innere Oberfläche des Plattendeckels. Geben Sie mithilfe eines Mehrkanalpipettiersystems 10 ml PBS auf die Platte. Drehen Sie den Plattenboden schnell um und setzen Sie ihn vorsichtig auf den Deckel, um Hänge-Tröpfchen zu bilden.

Wenn der Plattenverschluss angebracht ist, überführen Sie die Platte vorsichtig in die Inkubationskultur. Die Zellen bleiben zwei Tage lang ungestört. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, überführen wir die Hängentropfenkultur in Platten mit ultra niedriger Anhaftung.

Nach zwei Tagen die Plattenabdeckung vorsichtig umdrehen, anschließend 180 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium abpipettieren und mehrere Tropfen in eine 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte geben. Danach die Tropfen mit einer Pipette aufnehmen und einzeln in die 96-Well-Platte überführen. Die Platten für drei Tage ungestört in den Inkubator stellen.

Die Embryoidkörper wachsen weiter zu einer kugelförmigen Struktur heran. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, können die Embryoidkörper ausgeplattet werden, um ihre weitere Differenzierung zu unterstützen.

Wir überführen sie in eine 48-Well-Platte, die mit Gelatine beschichtet ist. Dazu beschichten wir zunächst jedes Well der Platte mit 300 µL 0,1 %iger Gelatine. Nach dem Zugabe der Gelatine inkubieren wir die Platte über Nacht bei 37 °C.

Am nächsten Tag wird das Gelatine aus der 48-Loch-Platte abgesaugt. Anschließend werden 300 Mikroliter Differenzierungsmedium in jedes Loch gegeben. Nun werden die Embryoidkörper einzeln von der 96-Loch-Platte auf die mit Gelatine beschichteten 48-Loch-Platten übertragen.

Normalerweise wechseln wir am nächsten Tag das Medium und danach jeden zweiten Tag, um die Zellen zu erhalten. Mit dieser Methode suchen wir nach besseren Protokollen zur Differenzierung embryonaler Stammzellen. In den Kardiomyozyten haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man die in-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus mittels Hängender-Tropfen-Kulturen durchführt.

Diese Methode ist wirksam, weil der runde Boden des hängenden Tropfens die Aggregation von embryonalen Stammzellen ermöglicht und somit ein günstiges Umfeld für die Bildung von Embryoidkörpern bietet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Anzahl der in einem hängenden Tropfen aggregierten embryonalen Stammzellen durch die Variation der Zellzahl in der anfänglichen Zellsuspension gesteuert werden kann. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.