Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, murine embryonale Stammzellen in Motoneuronen zu differenzieren. Kultivieren Sie zunächst murine embryonale Stammzellen auf primären murinen embryonalen Fibroblasten und ergänzen Sie das Kulturmedium mit Leukämie-Hemmungsfaktor. Anschließend fördern Sie den Differenzierungsprozess durch Zugabe von Noggin, bFGF und FGF8, und induzieren die Spezifikation von Motoneuronen durch Inkubation mit Retinsäure und einem Smoothened-Agonisten, woraufhin die Axonverlängerung und die Reifung der Motoneuronen erfolgt.

Verwenden Sie abschließend die Immunfluoreszenzmikroskopie, um differenzierte MES-Zellen zu untersuchen, die eine starke GFP-Fluoreszenz exprimieren. Die Erzeugung großer Mengen von Motoneuronen erleichterte die Forschung zu Motoneuronerkrankungen im Vergleich zu bestehenden derzeitigen Protokollen. Diese Methode zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneurone ist effizienter. Diese Methode kann Einblicke in die spinale Muskelatrophie ermöglichen.

Es kann auch auf andere Motoneuronerkrankungen wie die amyotrophe Lateralsklerose angewendet werden. Um primäre embryonale Mausfibroblasten zu plattieren, beschichten Sie vier Zellkulturschalen mit je 100 Millimeter Durchmesser mit jeweils acht Milliliter einer 0,1 %igen Gelatine-Lösung. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die überschüssige Flüssigkeit entfernt. Verdünnen Sie nun ein Gefäß Mitomycin C in aktiviertem PMEF-Medium und geben Sie es in insgesamt 40 Milliliter PMEF-Medium, verteilen Sie dieses auf die vier Schalen und kultivieren Sie bis zu einer Woche lang.

Als Nächstes eine Phiole mit MES-Zellen im 37-Grad-Wasserbad auftauen. Die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern E-ES-Medien waschen. Nach dem Zentrifugieren bei 800 U/min für fünf Minuten.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die MES-Zellen in 20 Milliliter ES-Medien mit frisch zugegebenem Leukämie-Hemmfaktor. Entfernen Sie anschließend 10 Milliliter Medium aus den PMEF-Kulturen und ersetzen Sie es durch 10 Milliliter der HBG-drei-ES-Zellsuspension. Überwachen Sie die Entwicklung der MES-Zellen im Zeitverlauf, beginnend mit kleinen Kolonien nach 24 Stunden bis hin zu Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 100 Mikrometern nach 72 Stunden ab dem Ansäen.

Ersetzen Sie das Medium täglich, um die Proliferation der Zellen für die Induktion von MES-Zellen aufrechtzuerhalten. Differenzierung in Motoneuronen. Die embryonalen Stammzellen der Maus müssen zunächst von den PMEF-Fütterungszellen getrennt und dann am Tag der Induktion in einer Suspensionsumgebung kultiviert werden.

Für jede 100 Millimeter ES-Kultur bereiten Sie einen T150-Fläschchen vor, der mit 0,1 % Gelatine beschichtet ist. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur entfernen Sie die überschüssige Gelatine und waschen dreimal mit PBS. Danach saugen Sie vorsichtig das Medium aus der ES-Kultur ab, wobei Sie sicherstellen müssen, dass locker angeheftete Kolonien nicht gelöst werden. Anschließend waschen Sie einmal mit 10 Milliliter PBS.

Um nun MES-Zellen von PMEF zu trennen, drei Milliliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen, ob die Stammzellen und die PMEF sich von der Platte gelöst haben. Anschließend 15 Milliliter frisches ES-Medium hinzufügen und die Kolonien durch Pipettieren aufbrechen.

Überführen Sie die Zellsuspension in den vorbereiteten, mit Gelatine beschichteten T-150-Fläschchen und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, damit die PFS-Zellen an der gelatinisierten Oberfläche anheften können. Sammeln Sie nun die schwimmenden MES-Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter neuraler Differenzierungsmedium.

Mittels eines Hämocytometers mittlere Zellzahl bestimmen und anschließend auf eine 100 Millimeter Suspensionkulturschale zur Differenzierung ausplattieren. Am ersten Tag mittels Mikroskopie überprüfen, ob die MES-Zellen kleine schwimmende Aggregate, sogenannte embryonale Körperchen, gebildet haben. Da eventuell übertragene PMEF-Zellen an der Schale haften können, die ES-Suspensionszellen samt Medium in ein 15 Milliliter-Röhrchen überführen und dann drei Minuten bei 500 U/min zentrifugieren.

Um die embryonalen Körperchen zu gewinnen, das Medium vorsichtig abpipettieren, 10 Milliliter frisches neuronales Differenzierungsmedium zum pelletierten EBs hinzufügen und die Zellen anschließend 24 Stunden lang in einer neuen Bakterienkulturschale zur Differenzierung ausplattieren. Am zweiten Tag die Kulturschale schwenken und das Medium sowie die EBs in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Die EBs durch Schwerkraft absetzen lassen, dann das Medium vorsichtig abpipettieren und die EBs in 10 Milliliter Motorneuronen-Differenzierungsmedium resuspendieren.

Kultivieren Sie das Medium EBS fünf Tage lang in einer neuen Bakterienschale zur Differenzierung. Am Tag sieben überprüfen, ob die EBS einen Durchmesser von etwa 150 bis 200 Mikrometern aufweisen und starke GFP-Signale bei der Differenzierung exprimieren. Am Tag fünf, zwei Tage vor der Dissoziation der EBS, 12-Millimeter-runde Deckgläser auf den Boden einer 24-Loch-Platte geben.

Fügen Sie dann 0,5 Milliliter einer 100 Mikrogramm pro Milliliter-Lösung von Poly-DL-Ornithin hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie das Poly-DL-Ornithin, lassen Sie die Platten und Deckgläser in einem Zellkulturwerk abtrocknen und spülen Sie die Plattenmulden dreimal mit doppelt destilliertem Wasser aus.

Lassen Sie die Deckgläser zur Beschichtung lufttrocknen. Stellen Sie eine frische Verdünnung von zwei Mikrogramm pro Milliliter Maus-Laminin in fünf Millilitern eiskaltem 1× PBS her. Geben Sie 0,5 Milliliter pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Zweimal mit PBS am Differenzierungstag waschen. Am siebten Tag die EBS in ein 15-Milliliter-Gefäß sammeln und die EBS durch Schwerkraft sedimentieren lassen. Nach viermaligem Waschen mit PBS vorsichtig ein Milliliter ACU max zur EBS hinzufügen, vorsichtig mischen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend überschüssiges ACU max über der EBS abpipettieren.

Jetzt drei Milliliter MND-Medium hinzufügen und die EBS durch etwa 20-maliges Pipettieren mit einer Einweg-Mikropipette mit einem Milliliter Volumen auflockern, anschließend zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und die Zellsuspension durch eine Zelltrichterkappe in ein 12 × 75 mm-Röhrchen überführen. Diesen Dissoziationsschritt mit den verbleibenden Zellaggregaten und Zellen, die durch den Filter zurückgehalten wurden, wiederholen, um die Ausbeute an Einzelzellen in einer endgültigen Einzelzell-Suspension von sechs Millilitern zu erhöhen. Die Einzelzell-Suspension vorsichtig mischen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen; anschließend die Zellen in vollständigem MND-Medium auf eine Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Milliliter verdünnen und in eine Platte geben.

0,5 Milliliter Zellsuspension pro Vertiefung in die vorbereiteten 24-Loch-Platten, die Deckgläser mit Poly-DL-Ornithin-Laminin-Beschichtung enthalten. Die differenzierten Zellen bilden nach zwei Tagen lange Neuriten aus. In Kultur ist HBG drei eine ES-Zelllinie, die aus einem transgenen Mausstamm stammt, der EGFP unter Kontrolle eines motorneuronenspezifischen Promotors, HB nine, mit einem definierten Differenzierungsprotokoll exprimiert.

MES-Zellen können zur Gewinnung von Motoneuronen verwendet werden. Die undifferenzierten MES-Zellen bilden runde Kolonien auf der Oberseite einer Fibroblasten-Füttererschicht. Sie weisen einen schwachen GFP-Ausdruck auf.

Diese MES-Zellen wurden von Füttererschichten getrennt und auf niedrig haftenden Schalen kultiviert, um embryonale Körperchen zu bilden. Differenzierte MES-Zellen zeigten nach Tag sieben eine starke GFP-Fluoreszenz. Differenzierte EBS wurden aufgelöst und auf mit Poly-DL-Ornithin-Laminin beschichteten Platten ausplattiert.

Die differenzierten Zellen bilden zwei Tage nach der Kultivierung lange Neurite von den Zellkörpern der platzierten Zellen aus; die aus MES-Zellen stammenden Motoneurone können mittels Immunfluoreszenzfärbung charakterisiert werden. Diese GFP-positiven Zellen exprimieren den allgemeinen neuronalen Marker Neurofilament sowie zwei spezifische Marker für Motoneurone. Eyelid One und Cholinacetyltransferase, sowie DPI-Färbung der Kerne, werden gemeinsam dargestellt.

Unser zweistufiges Differenzierungsprotokoll bietet eine effiziente Methode, um MES-Zellen in spinale motorische Neuronen zu differenzieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie verstehen, wie man embryonale Stammzellen der Maus effizient in motorische Neuronen differenziert. Abschließend ist zu beachten, dass die hohe Qualität embryonaler Stammzellen der Maus der kritischste Parameter für die effiziente Generierung motorischer Neuronen ist.