Procesamiento de los Pinus taeda PtGen2 cDNA microarray
20 de marzo de 2009
El cDNA microarrays PtGen2 fue desarrollado para estudios de expresión génica en el pino de incienso, P. taeda, Y otras especies de coníferas. Aquí, se muestra pre-y post-hibridación manejo y técnicas de lavado que se pueden utilizar con esta matriz para obtener una mejor consistencia, artefactos reducidos y menores fondos.
Este video fue producido por investigadores de la Escuela Warnell de Silvicultura y Recursos Naturales de la Universidad de Georgia. El objetivo de este video de capacitación es detallar cómo procesar nuestra micromatriz de ADNc de pino lolly LOB, gen dos, prestando especial atención al lavado y manejo de la matriz, tanto antes como después de la hibridación. En general, nuestros protocolos siguen los desarrollados por el Instituto de Investigación Genómica (TIGR) y la Instalación Compartida de Micromatrices de Vanderbilt (VMSR), donde se imprimen nuestras matrices.
Hemos descubierto que se requiere un procesamiento más riguroso del PT Gen dos para lograr la mayor consistencia posible en cuanto a la uniformidad de la calidad de la señal y fondos bajos. El primer paso es un prelavado. Hacemos esto porque nuestro tampón de impresión contiene un contenido muy alto de sal y este prelavado es necesario para eliminar dicha sal.
Las láminas se colocan en un portaportaobjetos para microscopio y se sumergen vigorosamente de 15 a 20 veces en una solución de SDS al 0,2 % que se ha precalentado a 43 grados. Después de lavar las láminas en la solución de SDS, se retiran cuidadosamente con pinzas y se colocan en un frasco Copeland que contiene tampón de prehibridación. Este tampón contiene cinco XSSC, SDS al 0,1 % y BSA al 1 %, y también se calienta a 43 grados.
El frasco Copeland se cubre con parafina y se coloca en un incubador a 43 grados durante una hora. Tras la prehibridación, se retiran las laminillas y se colocan en un portaportaobjetos, procesándolas sucesivamente mediante cinco cambios de agua desionizada, sumergiéndolas de 15 a 20 veces en cada cambio. Finalmente, las laminillas se colocan en isopropanol y se sumergen cinco o seis veces antes de centrifugarlas hasta secarlas en una centrífuga chip M mate.
Después de la centrifugación, se soplan las láminas con aire comprimido que ha pasado a través de un filtro de 0,2 micrones. Luego, se colocan encima cubreobjetos elevadores, que también han sido limpiados con aire comprimido, y utilizamos la punta de una pipeta pequeña para ajustar el cubreobjeto elevador en la posición correcta sobre la lámina.
Después de colocar las láminas separadoras, pero antes de añadir el tampón de hibridación, agregamos 20 microlitros de dihi de 100 milimolares, tres atol, a los pozos de humedad ubicados en los extremos de la cámara. Ahora estamos listos para añadir las ADNc diana, que han sido resuspendidas en tampón de hibridación. La punta de la pipeta se coloca en el borde de la lámina separadora y del portaobjetos, y la solución se pipetea lentamente.
Descubrimos que utilizar el efecto capilar para cargar los arreglos proporciona la mayor consistencia y reduce considerablemente la incorporación de burbujas no deseadas. Después de que el material diana se ha añadido al arreglo, se ensambla la cámara de hibridación y se cubre con papel de aluminio. A continuación, la cámara de hibridación se coloca en un baño de agua agitado para una incubación nocturna, típicamente de 14 a 16 horas.
El baño de agua se ajusta a 48 grados y el agitador se fija a 50 rpm. Es importante tener en cuenta también que, desde el momento de la adición de la solución de hibridación hasta todos los lavados posteriores a la hibridación, los procedimientos se realizan con poca luz para prevenir la fotooxidación. Al día siguiente, se retiran las laminillas de la cámara de hibridación y se colocan en un frasco Copeland que contiene la solución de lavado número uno, previamente calentada a 53 grados.
Se deja que los portaobjetos permanezcan en el frasco Copeland durante aproximadamente un minuto, hasta que los elevadores se desprendan por sí solos; en ese momento, los portaobjetos se retiran suavemente con pinzas y se colocan en un portaportaobjetos para microscopio para continuar con los lavados. A continuación, los portaobjetos se sumergen vigorosamente entre 15 y 20 veces en un segundo recipiente, que también contiene la solución de lavado número uno a 53 grados. Luego, el recipiente se cubre con parafilm y se coloca en un agitador de incubación con aire regulado a 53 grados y 100 RPM.
Después de la incubación de 10 minutos y la solución de lavado número uno, se sumergen vigorosamente las laminillas 15 a 20 veces en un recipiente con la solución de lavado número dos, que está a temperatura ambiente. Este recipiente se ha cubierto con película de parafina y se coloca nuevamente en un agitador a temperatura ambiente durante una incubación de 10 minutos. Finalmente, se retiran las laminillas de la solución de lavado número dos y se sumergen vigorosamente 15 a 20 veces en un recipiente con la solución de lavado número tres.
A continuación, se trasladan las laminillas a un segundo recipiente con la solución de lavado número tres, cubierta con perfil, y nuevamente se colocan en el agitador durante 10 minutos. Después del lavado final, se centrifugan las laminillas hasta que estén completamente secas. Para ello, se coloca una tapa Falcon de 15 ml dentro de un tubo cónico de 50 ml, y se introducen los arreglos con el código de barras hacia abajo en el tubo cónico.
Los tubos se centrifugan luego en una cabeza de rotor oscilante a 1500 RPM a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, se transfieren las placas a un segundo conjunto de tubos cónicos de 50 ml, que han sido cubiertos con papel de aluminio. A continuación, los tubos se purgan con gas nitrógeno, que se filtra a través de un filtro de 0,22 micrones, y se tapan para su transporte o almacenamiento hasta el escaneo.
Recopilamos datos de escaneo en un PerkinElmer ScanArray 5,000. La imagen de la matriz se cuadricula y los datos de escaneo brutos se procesan, y el análisis inicial de datos se realiza con la suite de software de imagen de BioDiscovery. A continuación, se normalizan las intensidades de señal de los puntos mientras se realizan análisis estadísticos con las herramientas BRB Array, un paquete estadístico robusto y de acceso gratuito para matrices de microarreglos que puede descargarse del Instituto Nacional del Cáncer.
Se realizan otros análisis estadísticos y búsquedas de patrones de expresión génica con la suite de análisis y patrones de expresión génica Jeep PPAs, otro paquete de análisis basado en la web disponible gratuitamente. Gracias por ver nuestro video sobre cómo procesar el microarreglo PT Gen dos de pino loblolly.
Las siguientes personas fueron responsables del contenido y la producción de este video de formación.
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Resumen
Este artículo presenta la micromatriz de ADNc PtGen2 desarrollada para estudios de expresión génica en pino loblolly y otras especies de coníferas. Detalla las técnicas de manejo y lavado previas y posteriores a la hibridación para mejorar la consistencia y reducir los artefactos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Análisis de expresión génica
- Tecnología de microarreglos
- Biología vegetal
Antecedentes
- Las micromatrices de ADNc son esenciales para estudiar la expresión génica.
- PtGen2 está diseñado específicamente para el pino taeda y otras coníferas.
- Las técnicas adecuadas de manipulación son cruciales para obtener resultados confiables.
- El alto contenido de sal en el tampón de inmunorreactividad requiere un prelavado.
Objetivo del estudio
- Para mejorar la consistencia de los datos de expresión génica.
- Para reducir el ruido de fondo en los resultados de microarreglos.
- Para proporcionar un protocolo estandarizado para los investigadores.
Métodos Utilizados
- Pre-lavado para eliminar la sal del tampón de impresión.
- Técnicas de lavado rigurosas tras la hibridación.
- Comparación con protocolos de instalaciones de investigación establecidas.
- Evaluación de la calidad de la señal y los niveles de fondo.
Resultados principales
- Se observó una mayor consistencia en la calidad de la señal.
- Se lograron niveles de fondo más bajos con técnicas refinadas.
- Los protocolos demostraron efectividad en múltiples experimentos.
- Se proporcionaron recomendaciones para estudios futuros.
Conclusiones
- Las técnicas mejoradas de manipulación y lavado son fundamentales para el éxito de las microarrays.
- Los protocolos estandarizados pueden conducir a datos más confiables de expresión génica.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para obtener mejores resultados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo aborda un desafío clave en genómica vegetal: obtener datos reproducibles de microarreglos a pesar de los tampones de alta salinidad utilizados en la impresión, que pueden introducir artefactos. Al estandarizar los pasos de lavado previos y posteriores a la hibridación, el método mejora la consistencia de los datos y reduce el ruido de fondo, lo que permite un perfilado fiable de la expresión génica en especies de coníferas. Esto contribuye a los esfuerzos de validación de objetivos en biotecnología forestal al posibilitar una detección más clara de genes diferencialmente expresados bajo condiciones experimentales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de respuestas transcripcionales en tejidos de coníferas, apoyando la comprobación de hipótesis en vías de estrés o desarrollo.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad técnica debida a artefactos de sales, mejorando la confianza en la identificación de dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce diapositivas de microarreglos estandarizadas y de bajo fondo, adecuadas para hibridaciones reproducibles entre grupos experimentales.
- Valor operativo: Establece un protocolo robusto de preparación de diapositivas que mejora la reproducibilidad y escalabilidad del ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar perfiles de expresión confiables de tejidos de pino, útiles para estudiar la adaptación ambiental o la formación de madera.
- Valor operativo: Facilita la comparabilidad entre estudios mediante un procesamiento consistente de portaobjetos, favoreciendo la continuidad traslacional.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el flujo de trabajo de biología de descubrimiento, apoyando específicamente el perfilado confiable de objetivos en sistemas de plantas no modelo donde las herramientas genéticas son limitadas.
- Biología del Descubrimiento: Permite el análisis de expresión basado en hipótesis en pino loblolly, aclarando las respuestas génicas en tejidos de raíz, aguja y tallo.
- Selección: Proporciona portaobjetos para microarreglos con calidad de señal uniforme, posibilitando la selección comparativa fiable de la expresión génica bajo distintas condiciones.
- Análisis: Genera datos de intensidad de señal limpios y normalizados, compatibles con herramientas posteriores como BRB Array Tools y JePPAs para análisis estadístico.
- Investigación Traducional: Apoya la continuidad desde el descubrimiento de genes hasta la validación funcional al proporcionar líneas base de expresión confiables.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable de preparación de portaobjetos que puede aplicarse en múltiples especies de coníferas y diseños experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en las mediciones de expresión génica al minimizar los artefactos derivados de sales y SDS.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad entre portaobjetos y laboratorios mediante pasos definidos de lavado y manipulación.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo de falsos positivos/negativos en el perfilado de expresión, favoreciendo decisiones más acertadas de avance/no avance en la validación de dianas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de genes candidatos basada en datos de expresión más limpios y confiables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de microarreglos y técnicas de hibridación.
- Necesita acceso a baños de agua con control de temperatura, incubadoras y centrífugas para el procesamiento de portaobjetos.
- Exige el uso de reactivos estandarizados, incluyendo SDS, SSC, BSA e isopropanol, para lavados y deshidratación.
- Requiere adaptar el control de humedad y el tiempo de hibridación según la fuente de ARN diana y el método de marcado.
- Limitación práctica: el tampón de impresión con alto contenido salino requiere un prelavado riguroso; la eliminación incompleta de sales puede persistir si se acortan los pasos.
