Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

Hola, mi nombre es Brad Hamilton. Soy científico en el departamento de Investigación y Desarrollo de STEM Gen. Hoy les mostraremos un procedimiento para reprogramar fibroblastos humanos utilizando factores de reprogramación entregados por lentivirus.

Este procedimiento puede utilizarse tanto para generar células IPS como para estudiar el proceso de reprogramación. Las células IPS son similares a las células ES en morfología, proliferación y capacidad de diferenciarse en todos los tipos de tejidos del cuerpo. Las células IPS humanas tienen una ventaja distintiva sobre las células ES, ya que exhiben propiedades clave de las células ES sin el dilema ético de destruir un embrión para obtener las células.

La generación de células IPS específicas del paciente evita un obstáculo importante para las terapias de medicina regenerativa personalizada, al eliminar el riesgo de rechazo inmunológico de células trasplantadas no autólogas. Comencemos. En varios puntos de este protocolo, se sustituye el medio de las células IPSC en desarrollo, o células madre pluripotentes inducidas, por medio condicionado con metilcolina.

La preparación de este medio lleva seis días. Por lo tanto, comience al menos una semana antes de que desee iniciar su experimento. Para comenzar, siembre cada pocillo de una seis.

Placa de pocillos con dos veces 10 a la quinta células alimentadoras cfu por ml en dos mililitros de medio de crecimiento para met. Incubar durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, cambiar el medio a cultivo de células humanas E-S-I-P-S.

Incubar el medio durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Recoger el sobrenadante y reemplazarlo con medio fresco cada 24 horas durante cuatro días. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros.

Suplemente el sobrenadante recolectado con 15 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico (BFGF). Obtendrá aproximadamente 16 mililitros de medio condicionado con met, almacene el sobrenadante recolectado cada día por separado a cuatro grados SIUs. El medio condicionado con met se puede almacenar de una a dos semanas a cuatro grados Celsius o durante varios meses a menos 20 grados Celsius.

Ahora que ha asegurado que su medio enriquecido con metionina estará listo cuando lo necesite, hablemos sobre la preparación de las células. La primera tarea para generar iPSC consiste en utilizar lentivirus para transducir células de fibroblastos de prepucio humano, o células BJ, con cuatro factores de transcripción característicos de las células madre. Para prepararse para la transducción, siembre las células BJ a una densidad de uno por diez a la quinta células por pocillo en una placa de seis pocillos y cultívelas.

Las células en dos mililitros de medio de crecimiento, incubadas durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono el mismo día. Comience a preparar las placas de alimentación con metotrexato añadiendo dos mililitros de gelatina al 0,1 % diluida en agua a una placa de seis pocillos e incubándola durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. La gelatina recubre los pocillos y sirve como matriz para las células.

Ahora las células BJ están listas para la transducción lentiviral para preparar el virus para la transducción. Suplemente dos mililitros de medio fresco con seis microgramos por mililitro de polibreno y cuatro lentivirus, cada uno expresando uno de los factores de transcripción humanos T cuatro, SO dos nanog y lin 28, de tal manera que cada uno tenga la misma multiplicidad de infección o MOI.

Estos lentivirus están todos incluidos en el conjunto de lentivirus de factores de reprogramación humana. Para realizar la transducción, simplemente sustituya el medio de crecimiento de las células BJ por el medio que contiene el virus. Agite suavemente la placa para que el medio recubra uniformemente el fondo.

Incubar durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono el mismo día. Retirar un vial de células alimentadoras de cf uno meto de nitrógeno líquido y descongelar. Retirar la solución de gelatina de las placas de alimentadoras meto, que ahora están recubiertas de gelatina cada una.

Añada 0,2 veces 10 a la quinta células en dos mililitros de medio de crecimiento para MES. Incube las células MES durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, desprenda las células BJ con tripsina-EDTA al 0,05 % y centrifugue a 200 G durante cinco minutos.

Tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y re suspenda las células en medio de crecimiento. Retire el medio de la placa de alimentación de metionina y agregue dos mililitros por pocillo de la suspensión de células BJ. La concentración de células BJ debe ser aproximadamente cinco veces 10 a la cuarta células por pocillo.

Incubar durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. 24 horas después de retirar las células BJ del plato alimentador con metotrexato, reemplazar el medio con E-S-I-P-S humano, que es un medio de cultivo para células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas. Continuar cambiando el medio cada 24 horas durante siete días.

El día siete, sustituya el medio de cultivo de células ES con dos mililitros de medio condicionado con metilo. Las células alimentadoras con metilo han estado proporcionando los factores solubles necesarios para cultivar células IPS. Pero ahora necesitamos añadir más de estos factores para mantener el cultivo saludable.

El medio condicionado por células alimentadoras de metilo contiene todos los factores solubles secretados por estas células tras una incubación nocturna a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Observando mediante el microscopio, seleccione una colonia celular. Distinguida por una apariencia compacta y abovedada en una placa fresca de 24 pocillos que previamente ha preparado 24 horas antes con células alimentadoras de metilo ccf uno, aísle la colonia seleccionada en cultivo de E-S-I-P-S humanas.

Medio suplementado con 10 micromolares de la molécula troncal Y 2 7 6 3 2, un inhibidor de quinasa dependiente. Cambie el medio de cultivo sin suplementar con la molécula troncal Y 2 7 6 3 2 cada 24 horas durante los primeros siete días.

Después de siete días, cambie el medio a met. Condicione las células al medio y continúe pasando las células hasta que muestren una morfología típica de células ES humanas. Busque colonias pequeñas, compactas y con forma de cúpula que tengan un borde definido.

Las colonias deben ser uniformes y tener una alta relación entre núcleo y citoplasma. En este punto, ha desarrollado colonias que presentan la morfología de células ES, pero ¿expresan también genes característicos de las células ES? Para averiguarlo, tiña las colonias con marcadores de pluripotencia como TRA 180 1 TRA one 60 SSEA four s, SE, a three T four sox, two nanog y SSEA one. Para comenzar, lave suavemente las células tres veces con PBS.

A continuación, fije las células con 500 microlitros de paraformaldehído al 4 % u otro fijador durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras 20 minutos, lave las células con PBS tres veces más para eliminar el fijador en exceso. A continuación, bloquee la unión inespecífica incubando las células en 500 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo durante una hora a temperatura ambiente. Tras el paso de bloqueo, añada 250 microlitros de anticuerpo primario diluido uno a 100 en tampón de bloqueo a cada pocillo.

Incubar bien las células con el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Lavar las células tres veces con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido. Incubar las células con 250 microlitros de anticuerpo secundario diluido uno a 300 en tampón bloqueante durante una hora a temperatura ambiente, manteniendo alejado de la luz para evitar el fotoblanqueo tras la incubación con el anticuerpo secundario.

Lave las células tres veces con PBS hasta el tercer lavado. Añada DPI a una microgramo por mililitro para teñir los núcleos. Por último, observe, analice la expresión génica de sus células IPS.

Bajo el microscopio, los resultados de morfología mostraron cuatro células de fibroblastos dérmicos humanos que fueron co-transducidas con T cuatro, SOX dos, nanog y lin 28; se observaron cambios morfológicos tan pronto como el día cuatro posterior a la transducción, y el grupo de células se volvió más compacto para el día 17. Expresión de marcadores de pluripotencia. Para caracterizar más a fondo las colonias de células IPS aisladas, buscamos la presencia de marcadores comunes de pluripotencia expresados en células ES. Las colonias exhibieron una fuerte actividad de fosfatasa alcalina.

Además, se realizó inmunoquímica o inmunocitoquímica (ICC) sobre colonias de células IPS con un panel de anticuerpos específicos para marcadores de pluripotencia, incluyendo los marcadores de superficie TA 180, TRA-1-60, SSEA-4 y SSEA-3, así como los marcadores nucleares Oct4, SOX2 y Nanog. Las colonias de IPS aisladas resultaron positivas para todos los marcadores. Los resultados de la ICC muestran que las células IPS exhibieron un patrón de expresión adecuado de los marcadores de pluripotencia, demostrando que estas células IPS se asemejan estrechamente a las células ES humanas indiferenciadas.

Acabamos de mostrarle cómo generar células IPS mediante la reprogramación de fibroblastos humanos con los genes de las células madre mediante un conjunto de lentivirus de factores de reprogramación humanos. Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta varios factores.

Primero, es posible que sea necesario modificar la relación entre el virus activo y la diana durante el paso de transducción primaria para lograr una eficiencia óptima de transducción. Segundo, la condición de crecimiento de las células diana puede tener un impacto. Las células sanas y proliferativas son más susceptibles a la reprogramación.

En tercer lugar, al modificar el protocolo para diferentes números de células, se recomienda ajustar proporcionalmente el número de células objetivo al área superficial del recipiente de cultivo. Por último, se debería considerar la aplicación de inhibidores de ROCK, como Y 2 7 6 3 2, para ayudar a garantizar un reprogramación exitosa, ya que estudios recientes han demostrado su utilidad para mejorar la supervivencia de colonias humanas de tipo yes. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.