La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

El objetivo general de este procedimiento es generar células IPS humanas mediante la sobreexpresión mediada por retrovirus de OCT cuatro, SOX 2, KLF cuatro y M, junto con un sistema reportero GFP. Esto se logra primero añadiendo la cantidad apropiada de retrovirus individuales que expresan GFP. A continuación, las células infectadas con el virus que expresa GFP se transfieren a placas recubiertas con gelatina al 0,1 % y fibroblastos embrionarios de ratón.

El tercer paso del procedimiento consiste en reemplazar el medio con medio de cultivo de células madre embrionarias humanas. Finalmente, se aíslan colonias IPS con silenciamiento de GFP que muestran una morfología similar a la de las células madre embrionarias humanas. En última instancia, los resultados muestran la expresión de marcadores pluripotentes endógenos mediante tinción inmunofluorescente y R-T-Q-P-C-R.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la tinción vital con marcadores superficiales pluripotentes y la observación de cambios morfológicos, es el iPad deseable. Las colonias celulares pueden aislarse fácilmente utilizando la pérdida de expresión de GFP como marcador de las células pluripotentes para iniciar el cultivo. Incube fibroblastos humanos en medio para fibroblastos un día antes de la infección; siembre una vez 10 a la quinta de fibroblastos humanos en un pozo de una placa de seis pozos. Al día siguiente, aspire el medio para eliminar las células muertas y agregue dos mililitros de medio fresco para fibroblastos con cinco microgramos por mililitro de sulfato de protamina.

Luego, agregue cuidadosamente la cantidad adecuada de cada virus que expresa GFP, correspondiente a una multiplicidad de infección de cinco. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche, un día después de la infección. Retire el sobrenadante viral y lave tres veces con dos mililitros de PBS.

Luego, agregue dos mililitros de medio para fibroblastos tres días después de la infección. Verifique la fluorescencia de GFP y reponga el pocillo con dos mililitros de medio para fibroblastos. Al día siguiente, siembre una vez 10 a la cuarta por centímetro cuadrado de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados o células alimentadoras tipo meth en medio para fibroblastos sobre una placa de Petri de 10 centímetros recubierta con gelatina al 0,1 %.

Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, desprenda los fibroblastos humanos infectados con un mililitro de tripsina-EDTA al 0,05 % durante cinco minutos a 37 grados Celsius y centrifugue durante cinco minutos a 200 ×g. Resuspenda las células en 10 mililitros de medio para fibroblastos y siembre nuevamente las células en placas previamente recubiertas con gelatina al 0,1 % con mfs. 24 horas después.

Sustituya el medio por medio de cultivo de HESC y cambie el medio diariamente. Las colonias con aspecto de ESC comenzarán a aparecer entre 20 y 27 días después de la infección, tras la visualización de colonias con aspecto de ESC bajo un microscopio de fluorescencia. Verifique la ausencia de fluorescencia GFP en una colonia que presente una morfología similar a la de las HSC.

Utilizando una pipeta de 10 microlitros, seleccione colonias individuales de IPSC y colóquelas en un pocillo de una placa de 12 pocillos recubierta con gelatina y metilo, suplementada con medio HESC. Cambie el medio diariamente y pase las células lavando la placa con un mililitro de DMM F 12.

Luego, agregue 0,5 mililitros de colagenasa e incube durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Lave las células dos veces con DM A MF 12. A continuación, agregue dos mililitros de medio fresco para HESC.

Luego, utilice un levantador de células para desagregar las colonias en fragmentos pequeños y desprender las células restantes de la placa. Transfiera los fragmentos resuspendidos de las colonias a un pocillo de una placa de seis pocillos recubierta con gelatina y con MEF, e incube a 37 grados Celsius durante dos días.

Para revisar las células mediante inmunofluorescencia. Lávelas tres veces con PBS y fíjelas con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave suavemente las células tres veces con PBS y permeabilícelas con Tritón X-100 al 0,2% en PBS durante 30 minutos.

Bloquee la unión no específica incubando las células con BSA al 3 % en PBS durante dos horas. A continuación, incube las células con el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados Celsius. Luego lave las células tres veces con PBS e incúbelas con el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.

Lave las células tres veces con PBS durante el último lavado. Añada dappy e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Observe las células mediante microscopía fluorescente para cuantificación en tiempo real.

PCR aísla ARN total de IPC humanas derivadas de fibroblastos humanos. Utilice un kit de aislamiento de ARN. Sintetice la primera cadena de ADNc utilizando transcriptasa inversa.

Luego, utilícelo como plantilla para QPCR para detectar genes de pluripotencia. Los fibroblastos humanos, BJ, que fueron infectados con un cóctel de retrovirus que portan OCT cuatro, SOX dos, KLF cuatro y Mick, muestran aquí los cambios morfológicos observados durante la reprogramación desde el día cinco. Al día 10, 14 y 21, las células comienzan a mostrar una morfología similar a la de las células madre embrionarias humanas después de 21 días, y las células pluripotentes inducidas se identifican mediante la fluorescencia de GFP.

Las células madre pluripotentes, como las ESC y las IPC, expresan la maquinaria molecular necesaria para reprimir la expresión génica de provirus. Sin embargo, los vectores retrovirales utilizados aquí expresan GFP junto con los genes de reprogramación mediante el LTR retroviral. Por lo tanto, se considera que las células que expresan GFP de manera continua están expresando transgenes sin silenciamiento génico del provirus, como se observa fielmente aquí; las colonias de iPSC reprogramadas que adquieren la red molecular de pluripotencia muestran ausencia de expresión de GFP.

Esta figura muestra el análisis de inmunohistoquímica de colonias derivadas de fibroblastos Detroit 5 51 con anticuerpos contra TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four y nano, como puede observarse con éxito. Las IPC reprogramadas expresan todos estos marcadores. Además, se realizó una R-T-P-C-R cuantitativa para analizar la expresión génica y reveló que T four SOX two, KLF four M y nano aumentaron significativamente en comparación con las células fibroblásticas parentales, pero de forma equivalente a la de las CSE H nine.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo infectar el virus, identificar y seleccionar las células IPA completamente programadas en liposomas utilizando microscopía de fluorescencia.