Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

En este artículo en video, se reprograman fibroblastos humanos adultos para generar células madre pluripotentes utilizando vectores retrovirales. Primero, los fibroblastos humanos se transducen con vectores retrovirales que codifican los factores de transcripción T tres cuatro, SOX dos, KLF cuatro y cmic.

Los fibroblastos infectados se cultivan sobre células alimentadoras embrionarias de ratón durante 14 a 28 días. Los cultivos resultantes se tiñen con el anticuerpo TRA 180 1 para identificar colonias de células reprogramadas. Las colonias positivas se transfieren luego a placas que contienen MEF para su expansión.

La tinción inmuno cito química confirma la expresión de marcadores de pluripotencia y el establecimiento de líneas celulares pluripotentes. Luego se deben realizar estudios adicionales para caracterizar más a fondo las líneas. Por lo general, las personas nuevas en la programación de células somáticas y en los cultivos de células madre pluripotentes inducidas humanas tendrán dificultades porque es complicado identificar las colonias correctas de IPSC.

El procedimiento será demostrado por la Dra. Sula Pollak, becaria postdoctoral de mi laboratorio. Comience este procedimiento sembrando células Phoenix AM FO a una densidad de aproximadamente siete a 8 millones de células por placa de 10 centímetros en 10 mililitros de DMEM con alta glucosa, coloque en el incubador y cultive durante la noche. Al día siguiente, prepare mezclas de transfección que contengan 12 microgramos de un vector que codifique ya sea T three four SOX, dos klf, cuatro cmic o el gen GFP y 35 microlitros de few gene six en un volumen total de 500 microlitros de DMEM con alta glucosa sin suero y con L-glutamina.

Incube las mezclas durante 20 minutos. Luego, para transfectar las células phoenix, pipete cuidadosamente los complejos de ADN en las placas que contienen las células phoenix, que deben estar entre un 70 y un 80 % confluentes. Incube las células a 37 grados centígrados durante seis a ocho horas.

Aspire el medio y sustitúyalo con ocho mililitros de DMEM con alta glucosa y antibióticos. Luego, devuelva las placas al incubador durante 12 horas tras la incubación. Utilice una pipeta para aspirar y recoger el medio que contiene el virus.

Luego, reemplace el medio y repita este proceso cada 12 horas hasta que se haya recogido el medio cuatro veces. Almacene el medio a cuatro grados centígrados. Una vez que se haya recogido todo el medio, combine todas las porciones y luego viértalo a través de un filtro de tapón de tubo de 0,45 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros para eliminar las células desprendidas y los restos celulares.

El medio filtrado, que contiene partículas virales, puede mantenerse en el refrigerador durante dos semanas sin perder actividad infecciosa. No se recomienda congelar. El día anterior al procedimiento de transducción, descongele el stock congelado de fibroblastos humanos adultos y agregue una vez 10 a la quinta células por cada pocillo de placas de seis pocillos recubiertas con gelatina.

Al día siguiente, en un tubo cónico de 50 mililitros, combine 3,5 mililitros de cada medio viral T four SOX two, klf four y cMyc, y agregue polibrena a una concentración final de seis microgramos por litro como control. Prepare un mililitro de medio viral GFP, tres mililitros de medio de cultivo y polibrena a una concentración final de seis microgramos por mililitro. Aspire el medio de la placa que contiene fibroblastos humanos.

Luego, agregue cuatro mililitros de medio vírico mixto o medio control y centrifugue las placas a 1600 G durante una hora a 20 grados centígrados. Tras la centrifugación, incube las placas durante aproximadamente 12 horas. A continuación, reemplace el medio vírico por medio de cultivo de fibroblastos e incube durante otras 12 horas.

Repita este proceso desde la infección hasta el cultivo en medio de fibroblastos, dos veces adicionales después de la última infección. Cultive los fibroblastos en DMEM durante 48 horas. Luego, verifique la eficiencia de la infección de las transducciones paralelas con el medio retroviral GFP.

A continuación, inicie la reprogramación de células somáticas a células pluripotentes. Los fibroblastos infectados se cultivan en medio de células madre embrionarias humanas o medio HES, sembrando fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs a una densidad de aproximadamente dos veces 10 a la quinta células por pocillo de la placa de seis pocillos tratada con gelatina, en medio de crecimiento para fibroblastos al día siguiente.

Divida los fibroblastos humanos infectados utilizando tripsina-EDTA al 0,05 % e siémbrélos a una densidad de aproximadamente 1,2 × 10⁴ por pocillo en medio de crecimiento para fibroblastos. Al día siguiente, sustituya el medio por medio HES que contenga butirato de sodio 0,5 milimolar durante los primeros siete días del reprogramación.

Cambie el medio diariamente. Reemplace los medios por medios HES sin butirato de sodio y continúe la reprogramación durante siete a 21 días adicionales. Cambie el medio cada día diariamente.

Revise las células transducidas en busca de cambios morfológicos. Aproximadamente 10 días después de transferir los fibroblastos transducidos a las células alimentadoras, comenzarán a aparecer colonias de células. Las colonias que contienen las células reprogramadas ahora se denominan células madre pluripotentes inducidas humanas o células iPS humanas.

Las colonias de células IPS humanas estarán listas para ser aisladas entre 14 y 28 días después de sembrarlas sobre las células alimentadoras MEF. En esta etapa, las colonias de células IPS humanas pueden transferirse a placas que contengan MEF o a placas recubiertas con matrigel. A continuación se muestra la transferencia a placas que contienen MEF, realizada un día antes de seleccionar las colonias de células IPS humanas: siembre placas de 24 pocillos que contengan células alimentadoras MEF irradiadas con rayos gamma en medio de crecimiento para fibroblastos.

Incubar a 37 grados Celsius con 5% de CO2 el día en que se seleccionarán las colonias de células IPS humanas. Aspirar el medio de crecimiento de fibroblastos de los ME Fs y lavarlos con PBS para eliminar cualquier rastro de FBS. Posteriormente, añadir 0,5 mililitros de medio de células madre embrionarias humanas o medio HES que contenga 10 micromolares de inhibidor ROCK Y 2 7 6 3 2 a cada pocillo; a continuación, utilizando un microscopio montado en una cabina de flujo laminar, examinar las placas de reprogramación para observar la formación de colonias de células IPS humanas.

Si es necesario, retire los fibroblastos que rodean las colonias de células IPS humanas con una aguja de calibre 21. Enjuague las placas con PBS y agregue medio HES fresco que contenga el anticuerpo específico vivo TRA 180 1. Devuelva las células al incubador a 37 grados centígrados con 5 %CO2.

Después de 30 minutos, reemplace el medio con medio HES fresco suplementado con 10 micromoles de inhibidor de rock. Luego, observe las colonias bajo el microscopio fluorescente. Marque las colonias positivas para TRA uno a 81.

Utilizando una aguja de calibre 21 como marcador objetivo, corte las colonias de células IPS humanas positivas para TRA 180 1 en varios fragmentos pequeños. A continuación, con una pipeta automática, transfiera los fragmentos de colonias de células IPS humanas a pozos individuales de una placa de 24 pozos con MEFs. Evite transferir células no IPS.

Coloque las placas en el incubador y permita que las colonias de células IPS humanas se adhieran durante 24 a 36 horas; cambie el medio diariamente. Las colonias de células IPS humanas con morfología adecuada similar a HE serán visibles 48 horas después de la transferencia inicial a una placa de 24 pocillos. Pase manualmente las colonias de células IPS humanas cada seis u ocho días cortándolas con una aguja de calibre 21. Expanda los cultivos a una placa de 12 pocillos y posteriormente a una placa de seis pocillos tras la expansión clonal.

Y al establecer las líneas celulares de IPS humanas, analice la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60, SSEA-4, T-3-4, SOX2 y Nanog mediante inmunoquímica una vez que las líneas hayan sido establecidas. La caracterización detallada puede incluir análisis de diferenciación in vitro e in vivo, análisis de cariotipo, análisis de silenciamiento de transgenes, estudios de metilación y estudios de expresión génica.

La transducción eficiente con medio que contiene retrovirus es fundamental para una reprogramación exitosa y para determinar la eficacia de la transducción viral. Se visualizaron fibroblastos humanos adultos derivados de un paciente con ataxia de Friedreich tras dos infecciones consecutivas con medio retroviral GFP; cuando los fibroblastos se infectaron mediante una simple incubación con el medio viral, menos del 20 % de las células fueron transducidas. Sin embargo, cuando la adición del medio retroviral GFP fue seguida inmediatamente por centrifugación, la eficiencia de transducción aumentó drásticamente.

Aquí, más del 80 % de las células son transducidas para realizar una caracterización inicial de las colonias de células IPS humanas aisladas. La expresión de marcadores de pluripotencia característicos de las células ES humanas se evaluó mediante inmunoquímica, como se muestra aquí. Las colonias de células IPS humanas aisladas fueron positivas para los marcadores de pluripotencia.

T tres cuatro SOX dos nano SSEA cuatro y TRA uno sesenta ADN. La tinción con Cos con DPI mostrada en los paneles superiores se detecta tanto en las colonias de células IPS humanas como en las células alimentadoras. Estos resultados demuestran que las células IPS humanas obtenidas mediante este protocolo de reprogramación expresan marcadores de pluripotencia adecuados, característicos de las células madre pluripotentes humanas indiferenciadas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reprogramar con éxito fibroblastos humanos en células madre pluripotentes utilizando la transducción retroviral para identificar correctamente colonias de células madre pluripotentes humanas y realizar la caracterización inicial de las CPMh.