Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

El sistema Bio Flux es un instrumento automatizado y un dispositivo microfluídico para realizar ensayos con células vivas bajo flujo de cizalladura controlado. Este sistema utiliza tecnología microfluídica de placas de pocillos para integrar dispositivos de celda de flujo a escala micrométrica en placas de pocillos estándar SBS. BioFlex puede utilizarse para realizar estudios de adhesión y agregación de plaquetas con alto rendimiento y volúmenes reducidos de sangre.

Se agrega sangre total marcada con un colorante fluorescente a los pocillos y luego se hace fluir a través de los canales. Bajo flujo de cizalladura controlado, se obtienen datos de microscopía de alta resolución, que cuantifican la adhesión y agregación de plaquetas en presencia de compuestos farmacológicos y otros parámetros variables. Hola, soy Mike Schwartz del laboratorio de I+D en Flexion Biosciences.

Hoy les mostraremos un procedimiento para el uso de celdas de flujo microfluídicas en ensayos de adhesión de plaquetas. Utilizamos este protocolo en nuestro laboratorio para una variedad de ensayos de biología vascular. Así que comencemos.

Antes de realizar el experimento con la celda de flujo, los canales microfluídicos de la placa Bio Flux deben prepararse con un recubrimiento proteico de interés; en este experimento se utilizará colágeno tipo I. Cada uno de los 24 canales experimentales de la placa Bio Flux se conecta a un pozo de entrada y a un pozo de salida para esta placa. El pozo de entrada es el pozo izquierdo que alimenta el canal, y el pozo de salida está a la derecha; diluya el stock de colágeno tipo I hasta una concentración de 200 microgramos por mililitro.

En ácido acético 0,02 molar, se necesitarán 20 microlitros para cada canal utilizado. Dado que este experimento requiere 11 canales, prepare 200 microlitros de recubrimiento de colágeno. Un canal permanece sin recubrir, mezclado mediante agitación suave con la punta de una pipeta micrométrica.

Agregue 20 microlitros de recubrimiento a cada canal respectivo utilizando una micropipeta para dispensar el líquido en el punzón interno del pocillo. Alimente el canal microfluídico de interés, como se muestra aquí con el colorante amarillo, incluyendo un canal sin colágeno como control negativo para la adhesión y agregación de plaquetas. Después de que se haya agregado el recubrimiento de colágeno a todos los canales respectivos, conecte la interfaz a la placa.

Si está utilizando la interfaz bio flux 1000, puede fijar ambos pestillos sobre la platina. Si está utilizando la interfaz Bio flux 200, primero apriete los cuatro tornillos con los dedos. Luego, una vez que todos estén colocados, utilice el destornillador de par para apretar completamente.

El destornillador de par hará clic cuando alcance el máximo. Utilizando el modo manual en el software de bioflujo, aplique perfusión a los canales de interés a 2D por centímetro cuadrado desde la salida. Usaremos un objetivo de baja potencia en un microscopio para localizar el pozo de entrada y observar cómo se llena con líquido el orificio interno opuesto.

Primero debería observar una pequeña gota de líquido que lentamente llena el punzón interno después de varios minutos, y cuando el punzón interno de entrada esté lleno, detenga la perfusión en todos los canales pulsando detener en el software. Incube la placa a temperatura ambiente durante una hora. Durante este período de incubación, puede comenzar a preparar la sangre completa al final de la incubación de una hora.

Una vez que la sangre haya sido preparada, retire la interfase y agregue un mililitro de PBS con iones de calcio y magnesio al orificio de salida. Comience la perfusión desde el pocillo de salida a dos dinas por centímetro cuadrado y continúe la perfusión durante 10 minutos. Después de 10 minutos, detenga la perfusión. Tras retirar la interfase, elimine el exceso de PBS de los pocillos de entrada y salida.

Nunca retire el líquido que llena el punzón interno. Para bloquear los canales, agregue un mililitro de solución bloqueadora a cada salida. El pocillo que se va a utilizar debe perfundirse desde el pocillo de salida a dos dina por centímetro cuadrado y continuar la perfusión durante 10 minutos.

Detenga la perfusión después de 10 minutos y retire la interfaz. Los canales ya están listos y pueden utilizarse durante el día mientras la placa se recubre con colágeno. Durante una incubación de una hora, se debe preparar sangre humana fresca de un individuo en ayunas para su visualización y paso a través de la placa.

La sangre debe extraerse con citrato de sodio como anticoagulante y utilizarse dentro de las tres horas posteriores a su recolección. Primero, añada un stock de calcio de cuatro milimolares en DMSO a la sangre en una dilución de uno a 1000 en volumen por volumen. Para obtener una concentración de cuatro micromolares de calcio, mezcle mediante inversión suave.

A continuación, distribuya un mililitro de la sangre marcada con am de calcio en diez tubos micro de un punto cinco mililitros. Añada el anticuerpo inhibidor GP dos B tres a a cada tubo en la dilución deseada. Asegúrese de incluir un control negativo sin anticuerpo y un control positivo con un anticuerpo no relacionado, mezclando mediante inversión suave.

Incube los tubos a temperatura ambiente durante una hora, mezclando mediante inversión suave cada 10 minutos antes de realizar el experimento en la celda de flujo. Debe configurarse un protocolo automatizado en el módulo de control de bioflujo para collagen.One. Establezca un protocolo para hacer circular la sangre a diez nueve centímetros cuadrados durante 10 minutos desde la salida.

Bueno, deben configurarse los parámetros de adquisición de datos del estación de trabajo BioFlex 1000, que incluyen la adquisición de las posiciones deseadas del portaobjetos en la longitud de onda fitz y la configuración de lapso de tiempo. Un plan típico de adquisición de imágenes para este protocolo comprendería un campo de visión por canal que se capturaría usando un objetivo de 10 x cada 30 segundos durante una duración total de 10 minutos. También son posibles campos adicionales de visión y configuraciones alternativas de lapso de tiempo.

Una vez configurado el protocolo automatizado y los parámetros de adquisición de datos, regrese a la placa BioFlex y retire el líquido de ambos lados del canal, excepto en los punzones internos. Teniendo cuidado de trabajar rápidamente, coloque 500 microlitros de sangre de cada condición en los pozos de salida de cada canal. Tenga en cuenta que los pozos de salida se utilizan para administrar la sangre porque representan el camino más corto hacia la zona de observación y proporcionarán una reacción más inmediata de la sangre con el recubrimiento de colágeno.

Además, coloque la sangre de control sin anticuerpo en un canal recubierto con colágeno y en otro que solo esté bloqueado. Coloque la placa en el microscopio del estación de trabajo BioFlex 1000 y sujete la interfaz. Realice la calibración de la lista de etapas localizando el primer punto de calibración, definido como el origen.

Luego localice y marque el segundo punto de calibración. Aplique esta calibración a la lista de etapas correspondiente. Esto asegura que todas las ubicaciones de visualización en la placa puedan encontrarse automáticamente.

Mueva la platina a uno de los canales que contiene sangre; ajuste los parámetros de captura de imagen, como el tiempo de exposición y la ganancia, en el software de montaje BioFlex. Inicie el flujo de trabajo correspondiente haciendo clic en el botón deseado. Esto iniciará simultáneamente el protocolo de flujo y la adquisición de imágenes.

Al final del experimento, retire la placa de la estación de trabajo BIOFLU 1000 y desecharla según las directrices institucionales. Utilizando canales microfluídicos recubiertos con colágeno del sistema Bio Flux. Con el tiempo se observa formación agresiva de trombos en la muestra de sangre de control no tratada.

En contraste, no se observa formación de trombos con el canal no recubierto. En un experimento realizado recientemente, el tamaño promedio de los agregados bajo condiciones de control fue de 2000 micrómetros cuadrados. GP IIb IIIa es un mediador potente de las interacciones entre plaquetas y de la estabilización de la agregación cuando se activa mediante adhesión al colágeno; como se muestra aquí, tras la incubación con anticuerpo anti-GP IIb IIIa durante una hora antes de la exposición al esfuerzo cortante, se observa una reducción en el tamaño de los trombos, así como una disminución en la frecuencia de formación de trombos.

Una respuesta dependiente de la dosis puede observarse típicamente a 10⁹ cm² y el valor de IC₅₀ para este inhibidor particular fue de 17 nanomolares. La inhibición máxima para este donante, en comparación con el control sin anticuerpo, fue del 11 % a 10¹⁰ cm². También está disponible una placa de 48 pocillos de alto esfuerzo cortante para realizar experimentos con sangre completa hasta 200 D por cm² o 5 000 segundos⁻¹.

Acabamos de mostrarle cómo utilizar canales de flujo microfluídicos para realizar experimentos de biología vascular fisiológicamente relevantes. Al realizar este protocolo, es importante recordar diluir el colágeno en el tampón adecuado. Utilice siempre una técnica correcta de pipeteo para evitar la introducción de burbujas de aire y siga siempre las normas de bioseguridad de su laboratorio.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.