Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

El objetivo general de este experimento es observar los efectos de Pseudomonas syringae pv. tomato en proteínas reguladas por redox en plantas de tomate. Primero, inocule las plantas de tomate con Pseudomonas syringae pv. tomato para inducir la infección por patógenos y la respuesta proteica. A continuación, tiña con DAB (diaminobencidina) para observar los cambios en las especies reactivas de oxígeno.

Luego realice la etiquetación con TMT de cisteínas para examinar las cisteínas reguladas por redox en las proteínas. Los resultados obtenidos pueden medir los cambios entre muestras tratadas y controles. Hola, soy Chen del departamento de biología y de la instalación de proteómica aquí en la Universidad de Florida.

La ventaja de nuestra etiquetado CTMT frente al método existente como la etiqueta de aleta recubierta con isótopo, también conocida como ASCA, es la capacidad de multiplexar mientras se analizan proteínas responsivas al redox a gran escala. Aunque esta demostración proporcionará información sobre las proteínas reguladas por redox en el tomate en respuesta a la infección por patógenos, el experimento puede aplicarse a otros sistemas como joof, ratones cu y otras plantas, así como al control de condiciones de estrés. Tuvimos por primera vez la idea de este método tras observar variaciones notables entre experimentos ICAD porque solo hay dos etiquetas disponibles.

La demostración VIR de este método es fundamental, ya que los pasos de marcado y enriquecimiento son difíciles de aprender. Es necesario minimizar las variaciones experimentales entre muestras marcadas y eliminar las regiones reductoras para garantizar un marcado eficiente. Comencemos. Cultive dos plántulas de tomate trasplantadas de tamaño similar en macetas de cuatro pulgadas de diámetro para el cultivo del inóculo.

Una capa continua de pseudomona singe en una placa A KBM. Raspar las bacterias en 20 mililitros de agua y preparar un inóculo bacteriano de aproximadamente 10 a la seis unidades formadoras de colonias por mililitro. En un litro de tampón de inoculación, sumergir las plantas de cuatro semanas de edad en la solución de inoculación bacteriana durante 30 segundos.

Luego, cúbralo inmediatamente con bolsas de plástico transparentes. Después del tiempo de inoculación deseado, recolecte la hoja completamente expandida colocando la epidermis hacia arriba en una solución de un miligramo por mililitro de colorante DAB y realice una infiltración al vacío durante 15 minutos. A continuación, incube las hojas en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche.

Ahora hierva las hojas teñidas en etanol al 95 % durante 10 minutos y almacénelas en etanol al 75 % utilizando un mortero para moler. Recolecte las hojas y tritúrelas hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido. Luego realice extracciones con fenol según se describe en el texto adjunto.

A continuación, precipite las proteínas extraídas con fenol utilizando cinco volúmenes de acetato de amonio 0,1 molar frío en metanol al 100 %. Recupere las proteínas por centrifugación y realice lavados del precipitado. Luego, re suspenda las muestras en 1,5 mililitros de etanol frío al 70 % y transfiera a un tubo microcentrífugo de dos mililitros.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante de etanol y seque brevemente el pellet en un evaporador al vacío. Disuelva las muestras en un tampón de extracción de proteínas desnaturalizante tras centrifugar para formar un pellet, recoja el sobrenadante y mida la concentración de proteína según el manual del fabricante. Para cada una de las seis etiquetas de masa, comience con 100 microgramos de muestra de proteína en un volumen igual de tampón de alquilación de acetamida IO 200 milimolar recién preparado para bloquear los grupos tiol libres; incube a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, para precipitar las proteínas, agregue un mililitro de acetona fría al 80 % y coloque a menos 20 grados Celsius durante la noche.

Centrifugue la proteína para obtener el precipitado y realice tres lavados con acetona al 80 %. Después de secar las muestras al aire sobre hielo, vuelva a suspender el precipitado en 50 microlitros de tampón de lisis. Luego, para reducir los enlaces disulfuro, agregue 0,5 microlitros de TCEP 100 milimolar e incube durante una hora a temperatura ambiente.

Disuelva las etiquetas añadiendo 20 microlitros de acetonitrilo a los tubos de reactivo. Vortexee y centrifugue brevemente para eliminar el exceso de TCEP. Cargue 50 microlitros de muestra en una columna MicroCon de tres KD. Añada 50 microlitros de tampón de lisis y centrifugue durante 15 minutos a 10 000 ×g y 4 °C.

Para recoger la muestra, retire la columna, inviértala en un tubo limpio y centrifugue. Verifique el pH de la muestra si es necesario. Ajuste el pH entre siete y ocho con ácido clorhídrico uno molar.

Añada cinco micro de liberación del reactivo TMT de cisteína e incube la reacción durante dos horas a temperatura ambiente, combine las muestras y agregue un volumen igual de tampón de muestra Laemmli, hiérvalo durante cinco minutos y separe en un gel precolado de poliacrilamida al 12 %. Después de lavar el gel tres veces con agua filtrada, tiña con azul de Coomassie durante una hora y desactive la tinción durante la noche en agua según las concentraciones de las bandas proteicas. Divida 12 fracciones por carril del gel. Corte cada fracción en trozos de un milímetro y colóquelos en un tubo de 1,5 mililitros.

Retenga completamente los trozos de gel con bicarbonato de amonio 0,1 molar en acetonitrilo al 50%. Ahora cubra los trozos con acetonitrilo al 100% durante 15 minutos. Retire el líquido y seque los trozos utilizando un vacío rápido.

A continuación, agregue un volumen igual de solución de tripsina y coloque en hielo para rehidratar. Luego, incube a 37 grados Celsius durante 12 a 16 horas para la digestión con tripsina. A continuación, retire el extracto proteico líquido de las muestras incubadas.

Detenga la reacción y elimine cualquier digestión proteica residual cubriendo los trozos de gel con ácido fórmico al 5 % y acetonitrilo al 50 %. Luego agite los trozos de gel durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a los tubos de muestra de proteína extraída tras dos extracciones adicionales.

Seque las muestras bajo vacío rápido en tubos de 0,5 mililitros. Prepare una suspensión al 50 % de resina anti-TMT en TBS a una concentración proporcional a la intensidad de la banda proteica respectiva. Lave la resina tres veces con un volumen de columna de TBS 1× y continúe agregando 200 microlitros de TBS a cada muestra.

Luego, transfiera a resina anti-TMT y agite a temperatura ambiente durante dos horas, seguido de agitación lenta durante la noche a cuatro grados Celsius. Cargue cada muestra en una columna. Realice lavados de columna de 200 microlitros cada uno.

Luego, eluir cada muestra tres veces con 200 microlitros de tampón de elución al 50% y secar al vacío. Resuspender las muestras en 12 microlitros de acetonitrilo al 3% con ácido fórmico al 0,1% e inyectar cinco microlitros directamente en una columna de HPLC. Eluir los péptidos utilizando un gradiente de aumento de acetonitrilo según se detalla en el texto adjunto.

Utilice espectrometría de masas para detectar péptidos en un flujo de trabajo superior dos por tres. Comience con un MS de una sola etapa. Luego adquiera tres espectros MS/MS con disociación por captura de iones de mayor energía seguidos de tres.

Ms.MS con disociación inducida por colisión para la identificación de proteínas. Analice los datos de espectrometría de masas utilizando un flujo de trabajo ramificado. Implemente un cuantificador de iones marcadores para cuantificar la relación.

Asimismo, procese el espectro MS de MSM mediante los nodos selector de espectro, normalizador de espectro y agrupador de espectros, y consulte los datos contra el motor de búsqueda Seaquest. Esta imagen muestra ejemplos de una hoja de planta de tomate controlada a la izquierda y una hoja inoculada con Pseudomonas a la derecha, tras teñir las hojas con DAB. El proceso de tinción con DES permite que la tinción histoquímica revele signos de especies reactivas de oxígeno en el tejido foliar.

Como era de esperar, el control no muestra una tinción significativa, mientras que las hojas tratadas con Pseudomonas presentan tinción positiva para la producción de peróxido de hidrógeno. Este ejemplo muestra la salida de datos de Proteome Discover de un pico de área proteínica regulado diferencialmente por redox para cada muestra, lo que permite la cuantificación absoluta. El área del pico entre las muestras de control y las inoculadas indica cantidades relativas.

Aquí, la regulación redox de una proteína entre una muestra control y una inoculada es similar. Picos de intensidad semejante sugieren la presencia de enlaces disulfuro no regulados por un cambio en el tratamiento. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse correctamente en una semana.

Recuerde mantener las muestras frías y las etiquetas organizadas. Además, use precauciones al manipular fenol, como guantes resistentes a productos químicos y trabajar en la campana extractora siguiendo este procedimiento. Otras medidas, como el análisis específico mediante espectrometría de masas de modificaciones postraduccionales, pueden realizarse para determinar otras modificaciones del sistema, como el ácido único y la simulación de gluten.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la CTMD de pie mediante DIB, habilitación y calificación redox 16.