Evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales Terciario de la pandemia del VIH-1 secuencia de bucle V3 R2 Corona Ab initio Plegable

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar las preferencias estructurales dinámicas de la secuencia del bucle V tres de la cepa R dos del VIH mediante el plegamiento AR, y correlacionar los resultados con las sensibilidades conocidas a la neutralización de la cepa R dos. Esto se logra seleccionando un fragmento adecuado del bucle V tres de la cepa R dos para plegarlo mediante AR bonni. Como segundo paso, se realiza la simulación del plegamiento, que explora todas las posibles conformaciones del fragmento del bucle de la cepa R dos y registra las conformaciones más probables en un archivo pila.

A continuación, se analizan las conformaciones registradas para determinar la preferencia estructural dinámica de la corona R dos V tres, que podría explicar su sensibilidad a la neutralización. Se obtienen resultados que muestran una preferencia por un segmento beta rígido en las posiciones 12 a 14 del bucle V tres, basada en la estructura secundaria, la preferencia y la distribución de energía del conjunto de conformaciones buscadas. Hola, soy Timothy Cardozo, hablándoles desde mi laboratorio en el Departamento de Farmacología de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York.

Hoy les mostraremos un procedimiento para el plegamiento ab initio de un bucle flexible en una proteína viral inmunogénica del VIH-1 conocida como GP120. El bucle flexible se conoce como el bucle V3 de esta glucoproteína de envoltura superficial del virus del VIH-1, y su extremo se conoce como la corona del bucle V3. Esta es la región que plegaremos.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para ayudarnos a identificar vías productivas hacia diseños exitosos de vacunas contra el VIH. Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, seleccione la secuencia de la corona V3 que se plegará in silico.

Estudios previos de este laboratorio indican que las posiciones 10 a 22 de cualquier secuencia del bucle V tres proporcionan los mejores resultados; realice los experimentos de plegamiento armenio utilizando los menús desplegables fáciles de usar en la interfaz gráfica de usuario o GUI del software de modelado molecular ICM Pro. Primero, debe construirse en el espacio virtual del ordenador la estructura atómica tridimensional del péptido correspondiente a esta secuencia. Para construir la estructura atómica tridimensional, vaya al menú archivo y seleccione nuevo.

Esto mostrará una pantalla con varias pestañas. Seleccione la pestaña de péptido y pegue o escriba la secuencia en el cuadro de texto. Haga clic en aceptar para generar la estructura tridimensional del péptido.

La estructura aparecerá en la ventana gráfica de ICM. Una vez que se haya construido la estructura tridimensional, vaya al menú de mecánica molecular y seleccione minimizar, lo cual mostrará un menú lateral. En el menú lateral, elija global.

Esto mostrará una pantalla con varios campos de entrada y casillas de verificación ya seleccionadas con los parámetros predeterminados. Si es necesario, cambie la selección para elegir el péptido que se va a plegar. Ajuste la longitud y la precisión de la simulación modificando respectivamente el número de movimientos globales y el número de llamadas a mínimos locales.

Seleccione todo para el plegamiento de todos los átomos del péptido. Luego, seleccione guardar película para crear un archivo de video del plegamiento. Finalmente, haga clic en aplicar para iniciar el plegamiento en la ventana gráfica.

El algoritmo comienza a plegar el péptido en diferentes conformaciones, calculando y registrando la energía del péptido para cada conformación. Una vez finalizado, se identificará y visualizará en la computadora la conformación más estable energéticamente del péptido, así como conformaciones alternativas con energía casi idéntica. Realizando el plegamiento de péptidos. Usar la interfaz gráfica muestra cómo se ve el plegamiento, pero no permite la selección ideal de parámetros para el plegamiento de la corona del bucle V tres.

Para este propósito, lo mejor es realizar el plegamiento desde la línea de comandos no gráfica utilizando un guion. Un guion es simplemente una serie de comandos de texto guardados línea por línea en un documento o archivo de texto, que se introducen automáticamente en el programa ICM y se ejecutan uno tras otro para plegar el bucle V tres mediante un guion de líneas de comandos. Primero, escriba un archivo de texto que se guardará en el disco duro del ordenador en un directorio local. Como antes, comience construyendo el péptido en el espacio virtual del ordenador.

Luego, asigne un nombre a la simulación y establezca el número de variables libres, que son los enlaces químicos en el péptido que quedan libres para rotar durante el plegamiento. A continuación, especifique cuánto tiempo durará la simulación para lograr el plegamiento óptimo del bucle V tres. Esto dependerá del número de variables libres identificadas en el paso anterior para determinar la precisión de la búsqueda conformacional en el experimento; establezca el número de pasos de búsqueda que se realizarán en cada mínimo local.

Luego, configure otros parámetros que han sido optimizados para la simulación según investigaciones previas, incluyendo la minimización de temperatura, el gradiente y la distribución de probabilidad. Tras la configuración de los parámetros experimentales, indique qué cálculos de energía se utilizarán durante el plegamiento. Aquí, la energía de Vander Vi se indica mediante el péptido interno VW.

La energía se indica mediante 14 energías de enlace de hidrógeno indicadas por HB electrostática. La energía se indica por El Salvation. La energía se denota mediante SF y la entropía se denota mediante EN. Especifique los ajustes finales, incluyendo los ángulos preferidos de la cadena principal y de la cadena lateral que se van a buscar y la confirmación inicial.

Finalmente, escriba el comando para ejecutar y guardar el cálculo. Una vez que el script se haya escrito y guardado como un archivo de texto, ejecútelo desde el símbolo del sistema del sistema operativo de la computadora. Como antes, se identificará la conformación del péptido más estable energéticamente, así como otras conformaciones alternativas con energía comparable, y se guardarán en el archivo del proyecto para su visualización en la computadora.

Una vez que el cálculo haya finalizado, abra el archivo seleccionando «abrir archivo» en el menú desplegable de EE. Muestre la molécula haciendo clic en la casilla junto a ella en el panel de trabajo y seleccione la vista de pila de mecánica molecular. Para ver la pila de conformaciones peptídicas superiores clasificadas por energía obtenidas del plegamiento, haga clic en la herramienta de trazado en la esquina inferior derecha del panel de pila para graficar los resultados.

Primero haga clic en aceptar en la ventana resultante y luego haga clic en la pestaña central del gráfico llamada mejor conformación. A continuación, haga clic en la primera fila de la tabla de resultados, que es la conformación de energía más baja encontrada en la búsqueda. La estructura del péptido se reorganizará en su conformación de energía más baja en la ventana gráfica.

Analice esta conformación en busca de características típicas de hoja beta o de hélice alfa, especialmente en las primeras cinco posiciones del péptido. Seleccione esta región en la secuencia y haga clic en el icono de estructura de bastones en la parte superior izquierda de la pantalla para mostrar todos los átomos. A continuación, se debe analizar la serie de resultados de energía para trazar las mejores conformaciones.

Si la confirmación de menor energía está separada por una brecha significativa de las otras confirmaciones, indica una tendencia hacia una estructura rígida. Para evaluar los resultados, abra el frasco del proyecto y seleccione la vista de pila de mecánica molecular; aparecerá una tabla con las confirmaciones de la pila. Visualice las confirmaciones de la pila haciendo clic en el icono del histograma.

Finalmente, haga clic en la opción "reproducción de la pila de mecánica molecular" para crear una animación en la pila y visualizar las preferencias conformacionales reveladas por el plegamiento aquí. Se muestran los resultados del plegamiento de R dos. La conformación no es alfa helicoidal y corresponde a una espiral aleatoria, como se esperaba para las coronas del bucle V tres, notablemente en el fragmento del residuo 12 al 14.

En el bucle V tres, se observa una clara preferencia conformacional de hebra beta a lo largo de toda la pila, y se observan muy pocas conformaciones alfa helicoidales. Una conformación local de hebra beta se reconoce por su forma lineal extendida. Esta es la ubicación de la inusual secuencia isoleucina prolina metionina de la cepa R dos, una secuencia rara en cepas de VIH en esta posición, y que se ha hipotetizado como responsable de las características inusuales de R dos.

Además, se observa un intervalo energético de casi tres unidades entre la conformación de energía más baja y la segunda conformación de energía más baja. Por lo tanto, la estructura abandona momentáneamente la conformación de energía más baja menos del 1 % del tiempo, lo que sugiere que la corona R dos V tres y su conformación local con tensión beta en las posiciones 12 a 14 poseen una estructura más rígida en lugar de ser completamente flexible en naturaleza. Acabamos de mostrarle cómo plegar una secuencia de corona en bucle V tres utilizando el algoritmo abio implementado en el software ICM, y le hemos mostrado cómo analizar los resultados utilizando la tensión R dos del virus del VIH.

Como ejemplo, al realizar este procedimiento, es importante elegir cuidadosamente la identidad del péptido plegado correspondiente a un fragmento de la corona V tres, y también es fundamental interpretar los resultados con respecto a la preferencia conformacional y la energía mediante la consulta con un experto modelador molecular. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.