Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

El objetivo general de este procedimiento es permitir una configuración rápida y confiable mediante automatización de matrices basadas en QPCR. Esto se logra primero preparando los conjuntos de cebadores para la matriz y preparando las mezclas maestras de muestras que se analizarán. A continuación, se utiliza ya sea un sistema robótico automatizado para la preparación de PCR o un sistema de pipeta electrónica en matriz para transferir con precisión la mezcla maestra de muestras y los conjuntos de cebadores a cada pocillo de una placa de 384 pocillos.

Una vez preparadas, las reacciones de PCR en placas de 384 pocillos se realizan con el programa de PCR basado en el cycler de luz cuatro 80 cyber. El paso final del procedimiento consiste en analizar los datos de qPCR y determinar los niveles de expresión relativos para cada par de cebadores ensayado, cada uno de los cuales dirige un ARNm específico. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la expresión de grandes conjuntos de ARNm.

Las matrices desarrolladas específicamente pueden dirigirse, por tanto, a perfiles completos de microARNs previos, a vías específicas o a moléculas clave en la infección viral mediante perfiles basados en QPCR. Hola, soy Dirk DMA del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Hoy les mostraremos cómo configurar QQPC rra en tiempo real y les presentaremos dos métodos.

Uno utilizando una pipeta irregular y otro utilizando un robot. Utilizamos esta tecnología para medir microARNs precursores y microARNs maduros en tumores humanos. La demostración de hoy será realizada por Pauline Chu y Kristen bu.

Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, retire las placas de cebadores que contienen 186 pares de cebadores en un formato de 96 pocillos a 0,5 pM almacenadas a menos 20 grados Celsius.

Después de descongelar las placas a temperatura ambiente, agite mediante vortex y centrifugue brevemente. También descongele dos veces la mezcla de PCR con cyber green a temperatura ambiente. Para el montaje de cada placa de 96 pocillos con cebadores, se necesitarán cuatro tubos de mezcla maestra. Prepare la mezcla maestra combinando cuatro microlitros de mezcla con cyber green, tres microlitros de agua libre de nucleasas para PCR y de 10 a 20 nanogramos de ADN o ADNc de la muestra por reacción en cada uno de cuatro tubos eppendorf de dos mililitros.

Cada tubo debe contener suficiente mezcla maestra para aproximadamente 100 reacciones, permitiendo exceso para el desperdicio por pipeteo. Vortexee los tubos einor para mezclar. Comience el montaje del ensayo de microARN precursor utilizando el robot Tecan EVO con la inicialización del robot y la carga del programa EVO wear.

Luego, enjuague el robot tres veces con 30 mililitros de líquido del sistema para eliminar las burbujas de aire que interferirían con la precisión de la pipetación. A continuación, prepare la plataforma del robot para incluir una placa de 384 pocillos y una placa de cebadores de 96 pocillos. Las mezclas maestras en un canal contienen 2% de lejía, un sistema lleno, recipiente de líquido y un recipiente de desecho vacío.

Inicie la corrida automatizada del robot seleccionando ejecutar dos veces al final del programa. Retire la placa de 384 pocillos y séllela con lámina de aluminio Light Cycler Four 80 Ceiling. Luego, centrifugue la placa.

Coloque brevemente la placa sellada de 384 pocillos en la posición uno del hotel. Luego repita este proceso para la placa de cebadores dos con nuevas mezclas maestras y una nueva placa de 384 pocillos. Coloque la placa de 384 pocillos sellada resultante en la posición dos del hotel.

Abra un nuevo programa de EVO Wear para cargar el ciclador térmico desde el hotel y configure los parámetros de ciclado. Luego seleccione ejecutar dos veces. Freedom Evo cargará automáticamente cada placa en el ciclador térmico y ejecutará el programa de ciclado HRM con verde cyber.

Una vez finalizado, revise y analice los resultados según se describe en el protocolo escrito como alternativa al uso del robot. Se puede utilizar una pipeta electrónica multicanal en matriz para comenzar a colocar el contenido del tubo de mezcla maestra en un reservorio.

Configure la pipeta electrónica para aspirar 16 microlitros de mezcla maestra con dos dispensaciones de ocho microlitros seguidas de un paso de purga. Después de configurar la pipeta, aspire 16 microlitros de mezcla maestra y comience a dispensarlos en una placa de 384 pocillos dispuesta en forma de rueda. Dispense los primeros ocho microlitros en cada fila alternativa de la columna uno, utilizando las filas A a O, dejando la siguiente columna vacía.

Dispense ocho microlitros adicionales en las mismas filas de la columna tres. A continuación, purgue sobre un recipiente de desecho y deseche las puntas siguiendo este patrón de dejar filas y columnas alternas. Dispense a través de toda la placa durante cinco ciclos más para pipetear la mezcla maestra dos.

Utilice las mismas filas que en la mezcla maestra uno, pero comience con la columna dos. Repita este procedimiento para las mezclas maestras tres y cuatro, comenzando con las columnas uno y dos respectivamente, pero esta vez utilizando la rosa B para la citación de la placa de cebadores por P.Her. Ajuste una pipeta electrónica para aspirar dos microlitros y dispensar dos microlitros, seguido de un paso de purga.

Transfiera dos microlitros de cebadores desde la columna uno, fila A hasta H de una placa de cebadores de 96 pocillos hacia cada otra columna de la fila uno de la placa de 384 pocillos, purgando sobre un recipiente de desecho y deseche las puntas. Repita este patrón para el cuarto cebador para las tres mezclas maestras restantes de las columnas uno y dos. Luego, continúe este proceso para las columnas dos a doce de la placa de cebadores de 96 pocillos, avanzando cada dos columnas en la placa de 384 pocillos por cada columna de cebadores.

A continuación, selle las placas con una tapa para ciclador térmico, papel de aluminio y centrifugue. Inmediatamente después de la centrifugación, coloque las placas en un ciclador térmico qPCR 4 80 y realice los ciclos utilizando el formato de detección HRM con colorante cyber green uno.

Utilizando las mismas condiciones de ciclado que antes, repita este procedimiento usando la placa de cebadores dos Eloqua en una placa fresca de 384 pocillos, empleando mezclas maestras recién preparadas. Las firmas de microARN precursor emergen mediante el perfilado utilizando una matriz novedosa basada en QPCR. Se calculó el delta CT promedio normalizado respecto a U seis y se cargaron los valores estandarizados en la matriz.

Software menor que produce tres grupos distintos mostrados como mapas de calor. La expresión relativa de cada microARN precursor se muestra en rojo y azul, representando un aumento y una disminución en la expresión relativa, respectivamente. La intensidad del color indica el grado de cambio en la expresión.

La mayoría de los microARNs precursores experimentaron pequeños cambios insignificantes, tal como se esperaba. Sin embargo, una pequeña porción de microARNs precursores aumentó significativamente a lo largo del experimento de curso temporal. Además, el nivel relativo de algunos microARNs precursores disminuyó drásticamente.

En algunos casos, también se agrupan juntos en el análisis del mapa de calor. Dependiendo del experimento, pueden surgir agrupaciones que dependan de la infección viral, de la expresión específica del tipo celular de microARNs precursoros o de microARNs precursoros que son regulados por una molécula común o una vía de señalización.

Se muestran los umbrales de ciclo promedio o cts de una muestra negativa para el virus del herpes asociado al sarcoma de Posey, analizada en cuádruple réplica. Es importante destacar que el antígeno nuclear asociado a la latencia del virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, o KSHV Lana, no fue detectado en esta muestra mediante la matriz QPCR altamente sensible. Sin embargo, tanto el control interno U seis como let siete a, una microARN precursora humana altamente expresada, se expresaron a niveles detectables.

Finalmente, como era de esperar, el control negativo de agua grado PCR no produjo producto A-Q-P-C-R. Un análisis de curva de fusión para dos cebadores diferentes. Se muestra el duplicado de la misma muestra.

Es evidente que la temperatura de fusión es diferente para los dos pares de cebadores, pero la muestra se está desnaturalizando a la misma temperatura exacta en cada réplica. Signos de una muestra mala o potencialmente contaminada pueden incluir varios picos de fusión que sugieren la presencia de dos fuentes diferentes de material de entrada. Acabamos de mostrarle cómo configurar experimentos de QPCR en tiempo real utilizando un robot.

Es importante que incluya todos los controles y tantos genes de mantenimiento como sea posible. Así que gracias por vernos y mucha suerte con sus experimentos.