Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

El objetivo general de este procedimiento es realizar un experimento de microarreglo de microARN. Esto se logra primero obteniendo láminas de microarreglo impresas que contienen una biblioteca de sondas de microARN y preparando muestras de ARN con calidad y cantidad adecuadas. A continuación, el ARN y una muestra control de ADN se etiquetan con colorantes fluorescentes.

Luego, los ácidos nucleicos marcados se añaden a una lámina de microarreglo para la hibridación. Finalmente, la lámina de microarreglo se lava y se escanea, y después se regenera. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión a nivel del genoma completo de microARNs mediante el análisis de la lámina para determinar las intensidades de hibridación de las sondas individuales de microARN.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la expresión génica, como cómo las condiciones fisiológicas normales o las condiciones patológicas afectan diferencialmente las necesidades de expresión de microarreglos a escala global. La calidad de la fabricación de microarreglos es uno de los factores más críticos para el éxito de un experimento de microarreglo. Después de aislar el ARN utilizando un método que preserve los ARN pequeños y resuspenderlo a una concentración igual o mayor a dos miligramos por mililitro, marque el ARN en un volumen de reacción de 20 microlitros mezclando primero aproximadamente 25 microgramos de ARN total con 0,5 microgramos de cinco prime P-C-U-D-Y 5 4 7 3 prime en un buffer uno X HEPs suplementado con T cuatro ARN Ligasa 1D TT y TP. Si hay menos ARN disponible, reduzca proporcionalmente la cantidad de ARN y el volumen de la reacción.

Si el ARN es muy diluido, agregue un portador como levadura o ARNt para ayudar con la precipitación; incube la reacción en hielo dentro de un refrigerador durante dos a 24 horas. A continuación, agregue acetato de sodio hasta una concentración de 0,3 molar y luego tres volúmenes de etanol, y precipite el ARN durante la noche a menos 20 grados Celsius. Para usar los portaobjetos por primera vez, prehíbridos en una solución filtrada de 3 XSSC, 0,1 % de SDS y 0,2 % de BSA durante 30 a 60 minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, sumerja los portaobjetos en agua varias veces. Luego, en isopropanol, seque los portaobjetos utilizando una centrífuga con adaptador para portaobjetos a 100 × g durante cinco minutos a 22 grados Celsius. Enjuague las tiras elevadoras en agua.

Luego en etanol antes de secar al aire, coloque un portaobjetos dentro de la base de una cámara de hibridación para microarreglos y una cubierta encima del portaobjetos de manera que la cubierta cubra el área de la sonda y sus tiras blancas. Ponga en contacto el portaobjetos en la oscuridad, centrifugue el ARN marcado precipitado, lávelo una vez con etanol al 70 % y seque el precipitado al aire. El precipitado debe tener un color rojizo.

Prepare una solución de hibridación utilizando entre una quinceava y una centésima parte en volumen del ADN de referencia marcado y purificado por cada muestra de ARN. Disuelva completamente el pellet de ARN con aproximadamente 60 microlitros de la solución de hibridación para asegurar que la solución no se seque. Durante la incubación, agregue 20 microlitros de agua a cada uno de los pozos humidificadores en la base de la cámara de hibridación de microarreglo.

Añada la mezcla de ARN marcado y ADN de referencia al portaobjetos. Utilizando una punta de pipeta fina, toque suavemente el borde del cubreobjetos elevador y, mediante succión, permita que la solución entre en el espacio entre el cubreobjetos elevador y el portaobjetos.

Coloque la tapa de la cámara de hibridación sobre la base. Luego selle la cámara con abrazaderas metálicas. Introduzca toda la cámara dentro de la bolsa de plástico que viene con el casete de la cámara.

Finalmente, coloque la caja de la cámara dentro de un recipiente con una toalla de papel húmeda. Luego cubra el recipiente con papel plástico y colóquelo dentro de un incubador de cultivo celular húmedo a 37 grados Celsius durante aproximadamente 24 horas. Para procesar las láminas después de la hibridación, desarme las cajas de la cámara una por una, sumerja una lámina y su portaobjetos en dos XSSC a 22 grados Celsius.

El deslizador se caerá naturalmente del portaobjetos; lave los portaobjetos dos veces con 0,8 XSSC y luego tres veces con 0,4 XSSC durante un total de uno a dos minutos. Seque los portaobjetos utilizando una centrífuga con adaptador para portaobjetos. A continuación, escanee los portaobjetos con un escáner de microarreglos y utilice un programa como blue fuse para cuantificar las intensidades en los archivos de imagen.

Inspeccione puntos individuales para excluir puntos anormales que suelen surgir durante la impresión de la placa con orificios o el manejo de la placa después de la hibridación. Para el análisis y presentación de datos, utilice programas como Gene Spring y Excel para reutilizar el microarreglo. Limpie la placa enjuagándola en agua y luego sumérjala en un recipiente de tinción con NaOH precalentado a un milimolar y SSC 0,1 X a 62 grados Celsius durante 10 a 20 minutos.

Repita la incubación por segunda vez. Lave las laminillas varias veces con agua durante hasta 60 minutos con agitación suave a 22 grados Celsius. Seque las laminillas utilizando una centrífuga y almacénelas a 22 grados Celsius.

Las láminas pueden usarse sin prehibridación. Esta figura muestra una imagen escaneada de un microarreglo que demuestra señales de hibridación muy precisas e intensas. Los puntos rojos resultaron de la hibridación del ADN de referencia, los puntos verdes de la muestra de ARN marcada con DY 5 47, y los puntos amarillos provinieron de la hibridación tanto del ADN como del ARN con las mismas sondas.

Los coeficientes de correlación de Pearson entre réplicas técnicas de hibridación de microarreglos son de aproximadamente 0,99, lo que indica una excelente reproducibilidad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento personalizado de microarreglo, no solo para cuantificar micronase, sino también para cuantificar otros tipos de ácidos nucleicos, como los ARNm.