Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

El objetivo general de este procedimiento es acoplar el muestreo de productos frescos mediante cinta adhesiva con la detección molecular de células completas de especies de Salmonella utilizando hibridación rápida de fluorescencia en dos híbridos, también conocida como FISH. Esto se logra primero aplicando cinta adhesiva al material deseado y extrayendo las células unidas a la superficie. Las cintas con células adheridas pueden analizarse directamente o someterse a enriquecimientos en fase sólida o líquida.

El segundo paso del procedimiento consiste en la fijación directa sobre cinta y deshidratación en una serie de etanol para células aludidas o enriquecidas en caldo. El segundo paso implica la fijación de las células en suspensión, seguida de la resuspensión de las células en tampón de almacenamiento. El tercer paso del procedimiento es realizar una hibridación rápida sobre cinta utilizando un cóctel de sondas de oligonucleótidos específicas para Salmonella, seguido de la eliminación del exceso de sonda mediante un lavado con tampón de enjuague; para muestras analizadas mediante fax, el paso de FISH se lleva a cabo en suspensión, y el exceso de sonda puede eliminarse mediante un simple paso de dilución antes del análisis.

El paso final del procedimiento consiste en contratinjar las células unidas a la cinta hibridada con DPI y examinarlas mediante microscopía de fluorescencia. Para análisis basados en hechos, no se requiere una tinción de contraste. En última instancia, este método proporciona un medio para la detección visual o citométrica de especies de Salmonella que podrían estar presentes en productos frescos muestreados.

La primera vez que tuve la idea para este método fue al leer sobre un grupo italiano que utilizaba un enfoque similar para examinar comunidades bacterianas en reliquias de piedra aerófila romana. Pero r e inicié una discusión sobre este trabajo en una clase que estaba impartiendo sobre métodos rápidos en microbiología de alimentos. Unas semanas después, comenzó un brote de salmonela asociado a productos frescos que finalmente enfermó a casi 1500 personas en 43 estados diferentes.

Aunque nuestro enfoque experimental ofrece una vía oportuna y práctica para la detección de tipos bacterianos específicos en productos frescos, también es lo suficientemente portátil como para permitir pruebas en el campo o en un entorno de producción de alimentos. Comience seleccionando una cinta para usar en el muestreo. Algunas opciones incluyen la cinta para hongos disponible comercialmente o contactos que son estériles y además están envasados para facilitar su uso.

Con un marcador permanente, dibuje cuadrados de un centímetro de lado sobre el lado no adhesivo de una tira de cinta adhesiva de 10 centímetros de longitud, utilizando una plantilla estéril de aluminio. Esto servirá como guía visual para indicar qué porción de la cinta se ha utilizado para tomar la muestra de la superficie alimentaria o ambiental, formando un lazo con forma de C con el lado adhesivo enfrentado hacia la superficie a muestrear. Para ello, sostenga los extremos adhesivos con el pulgar y el dedo medio, y coloque el dedo índice contra el cuadrado dibujado en la parte posterior de la cinta.

Coloque la cinta sobre la superficie que se va a muestrear y presione suavemente el área marcada contra la superficie sin soltar los bordes de la cinta. Utilice el dedo índice para asegurar que el lado adhesivo de la cinta entre en contacto completo con la superficie de la muestra. Evite las burbujas utilizando un movimiento uniforme.

Extraiga lentamente la cinta de la muestra. Para extraer físicamente los microbios unidos a la superficie, asegure la carga celular. Coloque la cinta con el lado adhesivo hacia arriba sobre un portaobjetos de vidrio. Utilizando una cinta transparente de oficina común, asegúrese de aplicar la tensión y estiramiento adecuados de la cinta para crear una superficie plana y sin arrugas.

Esto ayudará a minimizar problemas de deformación o encogimiento de la cinta durante el calentamiento posterior. Durante la hibridación, coloque la cinta con la cara hacia abajo sobre placas de agarosa XLT4 (xylose slicing tertile four o XLT4) de modo que las células muestreadas estén en contacto directo con la superficie de agarosa para facilitar la eliminación sencilla de la cinta de la superficie de agarosa.

Tras el enriquecimiento, la porción de la cinta con la muestra enriquecida se coloca al ras con la superficie del agar, y un extremo de la cinta se adhiere ligeramente. Los platos de Petri se invierten para evitar la condensación y se incuban a 35 grados Celsius. Para permitir un crecimiento suficiente de especies de Salmonella, la duración del período de incubación necesario para enriquecer las células hasta un nivel detectable dependerá de los niveles iniciales de contaminación por Salmonella.

Después del periodo de enriquecimiento deseado, abra la placa de agar, la cinta conservará su adherencia durante la incubación. Presione suavemente la cinta contra el agar utilizando el dedo índice para asegurar la recuperación máxima de microcolonias formadas. En la interfase entre la cinta y el agar, tome la cinta desde el borde adherido a la pared de la placa de Petri y retírela con un movimiento lento y uniforme. Utilizando cinta adhesiva transparente común, monte la cinta cargada con células con el lado adhesivo hacia arriba sobre un portaobjetos de microscopio, de modo que se cree una superficie plana y sin arrugas.

Realice la fijación celular en cinta durante 30 minutos a 25 grados Celsius cubriendo el área de contacto de la muestra con 500 microlitros de formalina tamponada neutra al 10 %. Deseche el fijador en un recipiente hermético bajo una campana química para minimizar la exposición a vapores irritantes o tóxicos. Lave la cinta una vez con solución salina tamponada con fosfato 1x o PBS, inundando suavemente la superficie de la cinta con PBS para deshidratar la muestra. Mediante una serie progresiva de etanol, prepare los tampones de prehibridación, hibridación y lavado utilizando soluciones comerciales de grado biología molecular, filtre mediante una jeringa de 0,22 micrómetros y caliente previamente los tampones de hibridación y lavado a 55 grados Celsius.

Añada sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia al tampón de hibridación precalentado para obtener una concentración final de sonda de cinco nanogramos por microlitro. Cubra el área de contacto de la muestra en la cinta con 300 microlitros del tampón de hibridación que contiene la mezcla de sondas e incube las células adheridas a la cinta en una cámara de incubación sellada y húmeda ajustada a 55 grados Celsius; para un incubador de contacto directo, como el instrumento en modo portaobjetos, hibridice durante 15 minutos. Tras la hibridación, se retiran los portaobjetos y se descarta la capa de tampón de hibridación que contiene la sonda. Enjuague brevemente y con suavidad con tampón de lavado precalentado mediante pipeteo.

Un pequeño volumen de tampón sobre una laminilla inclinada permite que las laminillas se sequen al aire para la detección de especies de *Salmonella* mediante microscopía de fluorescencia. Cubra la laminilla con aproximadamente 10 microlitros de Vector Shield H 1200, medio de montaje que contiene DAPI, el contraste nuclear, e incube en la oscuridad durante 10 minutos. Coloque aceite de inmersión sobre la cubierta, deslice y examine las muestras utilizando un objetivo de inmersión de alta magnificación.

El filtro DPI se utiliza para enfocar la muestra. Luego, el microscopio se cambia al filtro adecuado, y las células de Salmonella se cuentan visualmente según su fluorescencia verde o roja, dependiendo del colorante utilizado para marcar las sondas. Para la detección por citometría, transfiera las muestras suspendidas en PBS a tubos de muestreo redondos de cinco mililitros y examine usando un citómetro de flujo con excitación a 647 nanómetros.

Analice los datos utilizando el software FlowJo. El muestreo con cinta adhesiva de la serovariedad terica, Ty Murium, desde la superficie de un tomate artificialmente contaminado, facilita el análisis directo posterior a la muestra mediante microscopía o citometría de flujo de carga celular. Las cintas se procesaron para fluorescencia rápida en hibridación C dos, utilizando una combinación de sondas de ADN específicas para Salmonella marcadas con Texas Red, dependiendo de la concentración local inicial de células de Salmonella en la cinta.

El enriquecimiento en fase sólida produjo resultados que variaron desde microcolonias aisladas hasta crecimiento confluyente. Las células obtenidas mediante cinta pudieron analizarse mediante citometría de flujo y FISH combinada, ya sea inmediatamente después del muestreo o tras un enriquecimiento líquido de cinco horas en superficie a 35 grados Celsius.

Aunque hemos descrito el uso de la técnica de la cinta de pescado para la seguridad alimentaria, el método también tiene un buen potencial para su uso en otras disciplinas, incluyendo microbiología ambiental, patología vegetal o microbiología clínica. En paralelo con este procedimiento, se pueden realizar experimentos adicionales como pruebas bioquímicas o PCR en enriquecimientos de fase sólida o líquida a partir de muestras extraídas con cinta. Las pruebas pueden utilizarse para responder preguntas sobre una salmonella que pueda estar presente, preguntas que están fuera del alcance del procedimiento de pescado.