Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos
23 de abril de 2013
Se describe un método de ensayo sensor electroquímico para la detección e identificación bacteriana rápida. El ensayo implica una serie de sensores funcionalizado con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN para ARN ribosomal (ARNr) secuencias específicas de la especie. Sandwich hibridación de ARNr objetivo con la sonda de captura y una sonda de oligonucleótido detector de ADN unido a peroxidasa de rábano picante produce una corriente amperométrica medible.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en detectar e identificar bacterias mediante sensores electroquímicos. Para lograrlo, primero se libera el ARN ribosómico de las bacterias para permitir la hibridación con la sonda detectora fluorada como segundo paso; luego, el ARN ribosómico unido a la sonda detectora se añade al electrodo de trabajo, lo que permite la hibridación con la sonda de captura en la superficie del sensor. A continuación, se permite que el conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-fluoresceína se una a la sonda detectora fluorada.
Finalmente, en la corriente interferométrica, puede obtenerse la intensidad, cuya magnitud está correlacionada con el número de complejos formados por la sonda captora de ribosomas y la sonda detectora de ARN en la superficie del sensor. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos basados en cultivo es que las bacterias pueden detectarse e identificarse en aproximadamente 45 minutos, evitando el tiempo de incubación nocturna necesario para que una bacteria forme una colonia visible en una placa EDGAR. La aplicación de esta técnica mejoraría el manejo de las enfermedades infecciosas.
La detección temprana de patógenos bacterianos es esencial para la terapia antibiótica dirigida y para mejorar los resultados clínicos. Aunque este método es útil para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, también puede aplicarse a otros problemas diagnósticos, como la inmunodiagnóstico. Comience incubando la sonda de captura diluida con hexanoditiol durante 10 minutos a temperatura ambiente para asegurar que el grupo tiol de la sonda de captura se reduzca, lo que da como resultado resultados más consistentes.
Después de la incubación, aplique un chorro de nitrógeno sobre el oro. 16 chips de matriz sensora durante cinco segundos para eliminar cualquier humedad o partículas. Los volúmenes pequeños de líquido deben aplicarse cuidadosamente sobre el electrodo de trabajo en la matriz sensora. La demostración visual de esta técnica es fundamental.
Ya que realizar adecuadamente las técnicas de pipeteo, lavado y secado reduce considerablemente la variabilidad entre chips. A continuación, aplique seis microlitros de la mezcla de sonda de captura HDT diluida al electrodo de trabajo de los 16 sensores de la matriz de sensores y almacene los chips de sensores en una placa de Petri cubierta a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, lave los chips de sensores con agua desionizada durante dos a tres segundos, y luego seque los chips bajo una corriente de nitrógeno durante cinco segundos. Ahora, aplique seis microlitros de la solución de clorhidrato de atrio, cloruro de sodio, EDTA y mercaptoetanol al electrodo de trabajo de los 16 sensores, e incube los sensores durante 50 minutos en una placa de Petri a temperatura ambiente.
Para preparar las muestras para el ensayo del sensor electroquímico, transfiera un mililitro de cultivo bacteriano en fase logarítmica de crecimiento a un tubo de microcentrífuga y luego centrifugue las células durante cinco minutos a 16.000 ×g. Tenga en cuenta que las bacterias patógenas deben manipularse en una cabina de seguridad biológica.
Tras eliminar el snat, coloque una punta de pipeta que contenga 10 microlitros de hidróxido de sodio uno molar en la parte inferior del tubo de microcentrífuga y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspender completamente el precipitado. Después de incubar la suspensión a temperatura ambiente durante cinco minutos, añada 50 microlitros de PBS que contenga albúmina de suero bovino o BSA y una sonda detectora modificada con fluoresceína para neutralizar el lisado bacteriano. A continuación, incube el lisado neutralizado durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Comience este paso lavando la solución de mer-captoetanol de uno de los chips sensores preparados con agua desionizada durante dos o tres segundos. Después de secar el chip tal como se acaba de demostrar, aplique cuatro microlitros del lisado bacteriano neutralizado a los electrodos de trabajo. 14 de los sensores.
Luego, aplique cuatro microlitros del oligonucleótido puente en PBS más BSA más sonda detectora modificada con fluoresceína a los dos sensores de control positivo. Después de incubar el lisado y los sensores de control positivo durante 15 minutos, lave y seque todo el chip sensor como antes. Ahora, aplique cuatro microlitros de anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa de rábano picante o HRP en PBS que contiene caseína a los electrodos de trabajo de los 16 sensores.
Tras una incubación de 15 minutos, lave y seque el chip sensor. A continuación, coloque una etiqueta de pocillo en la superficie del chip sensor y cargue el chip en el soporte del sensor pipeteando 50 microlitros de sustrato TMB sobre los 16 sensores y cierre el soporte del chip sensor. Por último, utilice un lector de chips Helios para obtener mediciones de pirometría y telemetría cíclica para los 16 sensores.
El ensayo electroquímico recién descrito está estructurado de forma similar a un sándwich, al igual que Eliza, tal como se muestra en esta figura: la hibridación del ARN ribosomal diana con las sondas de captura y detección se desarrolla mediante una reacción redox catalizada por la HRP conjugada a fragmentos de anticuerpo anti-fluoresceína que se unen al enlace trifluoresceína en la sonda de detección. Un componente importante de la sensibilidad del ensayo es la química superficial del electrodo de oro. El electrodo de oro está recubierto con mercaptoetanol y hine ol, y se funcionaliza mediante la adición de sondas de captura diluidas.
La hibridación sándwich del ARN ribosómico diana con la sonda de captura y la sonda detectora marcada con fluoresceína da como resultado un complejo que se detecta mediante la adición del conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-fluoresceína y el sustrato TMB. La corriente paramétrica M es generada por el ciclo redox que resulta de la oxidación del TMB por la peroxidasa de rábano picante y la reducción del TMB por los electrones procedentes del electrodo. Los ensayos aquí descritos emplean un chip de matriz de sensores 16 con genética fluídica.
Cada uno de los sensores en la matriz contiene tres electrodos: de trabajo, de referencia y auxiliar, que tienen puntos de contacto en el borde del chip. El lector de chips posee clavijas de contacto (pogo pins) que se conectan con cada uno de los puntos de contacto. El lector de chips sirve como interfaz para la matriz de sensores con un potenciómetro controlado por un algoritmo informático.
Aquí se muestran ejemplos del flujo de corriente en un sensor electroquímico. El flujo de corriente en los sensores es artificialmente alto durante los primeros segundos tras iniciar las mediciones paramétricas. Debido a la acumulación de sustrato oxidado durante el tiempo transcurrido desde la aplicación de TMB sobre la superficie del sensor hasta el inicio del algoritmo del lector, el flujo de corriente alcanza rápidamente un estado estable y se pueden obtener lecturas fiables del sensor en menos de 60 segundos.
La variabilidad entre sensores es relativamente constante, por lo que es posible realizar 16 ensayos con sensores diferentes en paralelo en el chip de matriz de 16 sensores de fluidos genéticos. Los controles positivos y negativos son esenciales; como control positivo, se utiliza un oligonucleótido de ADN puente sintético que se hibrida con las sondas de captura y detección y sirve como blanco sintético de concentración conocida. Los resultados obtenidos utilizando el oligonucleótido puente funcionan como un control interno de calibración para minimizar la variación entre chips.
El mayor corriente negativo del electrodo, mayor será la señal. Al probar las sondas de captura y detección. El límite de detección debe determinarse mediante diluciones seriadas de una muestra de concentración conocida como se muestra en esta figura, existe una correlación logarítmica lineal entre la concentración de la muestra y la señal de salida dentro del rango dinámico del ensayo.
En estos gráficos de barras, se muestran los resultados representativos para muestras que contienen esia coli y kleb seal y amoníaco, que se encuentran frecuentemente en la orina de pacientes con infección del tracto urinario; las señales para la mayoría de los sensores serán bajas y similares, y estos resultados negativos pueden agruparse como la reactividad de señal de fondo. La pareja de sondas KE distingue canon de e coli. El oligonucleótido puente sirve como control positivo y estándar de calibración interno. Esta técnica puede aplicarse a la detección de bacterias resistentes a antibióticos en especímenes clínicos mediante la medición de la respuesta fenotípica de las bacterias a los antibióticos.
Esta técnica puede utilizarse para determinar la terapia óptima para un paciente individual. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar e identificar bacterias mediante la comparación de las corrientes atriales en los diferentes sensores específicos de especie en el chip.
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Descripción general
Este estudio presenta un método de ensayo con sensor electroquímico para la detección e identificación rápidas de bacterias. El método utiliza una matriz de sensores funcionalizada con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN dirigidas a secuencias específicas de ARN ribosómico.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Electroquímica
- Microbiología
- Tecnología de sensores
Antecedentes
- Los métodos tradicionales basados en cultivos para la detección bacteriana pueden tardar más de 24 horas.
- Las técnicas de detección rápida son esenciales para la gestión eficaz de enfermedades infecciosas.
- Los sensores electroquímicos ofrecen una alternativa prometedora para la identificación rápida.
- El ARN ribosómico es un blanco clave para la detección específica de especies.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo rápido para la detección bacteriana mediante sensores electroquímicos.
- Mejorar la velocidad de identificación bacteriana en comparación con los métodos convencionales.
- Utilizar el ARN ribosómico como blanco para la detección específica.
Métodos Utilizados
- Liberación de ARN ribosómico de bacterias para hibridación.
- Uso de una sonda detectora fluorada para unirse al ARN ribosómico.
- Hibridación del ARN unido a la sonda detectora con sondas de captura en la superficie del sensor.
- Medición de la corriente amperométrica para cuantificar la detección.
Resultados principales
- El ensayo permite la detección e identificación bacteriana en aproximadamente 45 minutos.
- La intensidad de la corriente amperométrica se correlaciona con la cantidad de ARN diana capturado.
- Este método reduce significativamente el tiempo necesario para la identificación bacteriana.
- Las aplicaciones potenciales incluyen una mejor gestión de las enfermedades infecciosas.
Conclusiones
- El ensayo con sensor electroquímico es un método rápido y eficaz para la detección bacteriana.
- Esta técnica puede mejorar el diagnóstico clínico y el manejo de enfermedades infecciosas.
- Estudios futuros podrían ampliar el rango de especies bacterianas detectables.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección y la identificación rápidas de bacterias en menos de 45 minutos abordan un cuello de botella crítico en el manejo de enfermedades infecciosas, permitiendo decisiones terapéuticas oportunas. Este enfoque basado en sensores electroquímicos apoya la validación de objetivos al proporcionar detección específica de especies mediante el ARN ribosómico con lecturas amperométricas cuantitativas. El método aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al reducir la dependencia de ensayos basados en cultivos lentos y mejorar la reproducibilidad del ensayo en una matriz de 16 sensores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante hibridación específica de ARN ribosómico y aclaración de vías.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos al proporcionar una validación funcional del blanco mediante hibridación sandwich de sondas de captura y detección.
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la selección de carteras al entregar mediciones cuantitativas actuales correlacionadas con la concentración de ARN diana.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la funcionalización consistente de la superficie del sensor con sondas de captura dilatadas.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante calibración interna utilizando controles de oligonucleótidos puente para minimizar la variabilidad entre chips.
- Valor científico: Destaca la preparación para cribado y la reutilización de la plataforma mediante el procesamiento paralelo de 16 sensores en una matriz fluidica genética para la evaluación confiable de compuestos o muestras.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia para enfermedades mediante la detección de patógenos del tracto urinario como E. coli y Klebsiella, alineándose con aplicaciones traslacionales de biomarcadores.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la medición rápida de la respuesta fenotípica a antibióticos para determinar la terapia óptima.
- Valor científico: Se centra en la predicción con reducción de riesgos mediante la vinculación de lecturas electroquímicas con la identificación bacteriana, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Sitúa el método en la fase inicial del descubrimiento para la identificación de candidatos, apoyando la comprobación de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos mediante la detección específica del ARNr.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías mediante hibridación de ARN ribosómico específico de especie.
- Selección: Describe la preparación y reproducibilidad del ensayo mediante mediciones cuantitativas de corriente amperométrica y controles internos de calibración.
- Análisis: Destaca las mediciones y resultados estadísticos que permiten la comparación de condiciones entre matrices de sensores, incluyendo la correlación entre la intensidad de la señal y la concentración del objetivo.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica mediante la medición de la respuesta fenotípica a antibióticos para la optimización de terapias.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable mediante el formato de chip con matriz de 16 sensores, lo que permite ensayos paralelos y estandarización entre plataformas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista en la detección bacteriana.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante el diseño de matrices de sensores y controles de calibración.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante identificación rápida.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en tiempos de detección de 45 minutos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electroquímica, biología molecular y química de superficies de sensores para la funcionalización de sondas y la ejecución del ensayo.
- Necesita instrumentación que incluya potenciostato, lector de matriz de sensores y sistemas de manejo de fluidos para la entrega precisa de reactivos.
- Exige estandarización entre equipos en el diseño de sondas, protocolos de inmovilización e interpretación de datos entre grupos de microbiología y desarrollo de ensayos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes objetivos bacterianos mediante el rediseño de las secuencias de las sondas de captura y detección según la variabilidad del ARNr.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de pasos de lisis bacteriana y liberación de ARN, que pueden requerir contención de bioseguridad para muestras patógenas.
