Western Blot: Preparación de muestras para la detección
14 de octubre de 2010
Western Blot es una técnica analítica para detectar proteínas específicas en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar la facilidad de realizar un Western blot utilizando productos adecuados. Tras la preparación de las muestras, las proteínas se separan según su tamaño y luego se transfieren a una fase sólida. Las proteínas se detectan entonces mediante el uso de anticuerpos, y la aplicación de protocolos adecuados y reactivos de alta calidad y costo-efectivos produce resultados mejorados en el Western blot.
Hola, soy Jesse Luhan, científico de I+D en EMD Chemicals en San Diego, California. EMD es una filial de Merck KGaA en Darmstadt, Alemania. Hoy les mostraremos un procedimiento de inmunotransferencia (western blotting).
Entonces comencemos. El primer paso en el inmunotransferencia es la preparación de la muestra. Inicie la preparación de la muestra centrifugando las células a baja velocidad, por ejemplo, cinco minutos a 2,500 ×g.
Tras la centrifugación, retire los pellet celulares. Resuspenda bien las células en el reactivo de extracción de proteínas Cyto Buster utilizando 150 microlitros por cada 10⁶ células. Incube la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, centrifugue la muestra durante cinco minutos a 16.000 ×g y cuatro grados Celsius tras la centrifugación. Transfiera el SNA clarificado a un tubo nuevo y continúe con el análisis. Una vez determinada la concentración de proteína de la muestra, prepare la muestra para cargarla en el gel y desnaturalizar la proteína.
Utilice un tampón de muestra que contenga un detergente desnaturalizante iónico, como el dodecil sulfato de sodio o SDS. Hierva la mezcla a 95-100 grados Celsius durante cinco minutos. Mediante un gel precolado disponible comercialmente, las proteínas pueden separarse rápidamente según su peso molecular.
Llene la unidad de electroforesis con tampón de corrida, que puede prepararse a partir de reactivos ofrecidos a través de la línea química Omni PU. Cargue la primera banda del pozo con el marcador de proteínas de trail mix. Este marcador tiene tres bandas de referencia que permiten el monitoreo durante la electroforesis.
Una vez que el gel está teñido, son visibles 10 bandas, que van desde 10 hasta 225 kilo Daltons. Cargue la muestra desnaturalizada en los pozos restantes. Corra el gel a 220 voltios durante una hora.
Una vez que las proteínas se han separado, tiña el gel con azul de kumasi para asegurar que las proteínas hayan migrado de manera uniforme y homogénea utilizando una tinción rápida y una tinción ultrasensible, que está lista para usar; no se requiere DS.Tinción. Así como las proteínas con carga eléctrica pueden ser inducidas a moverse a través de un gel en un campo eléctrico, las proteínas pueden transferirse en un campo eléctrico desde el gel hacia una membrana como NITROCELLULOSE o PVDF. Al usar membranas de PVDF, sumerja la membrana en metanol durante unos minutos, seguido de una equilibración en tampón de transferencia frío por cinco minutos. También sumerja el gel durante unos minutos en tampón de transferencia frío; la equilibración evita la contracción del gel durante la transferencia.
Para una transferencia húmeda, arme un sándwich del gel y la membrana entre esponja y papel. Luego sujete firmemente el conjunto después de asegurarse de que no se hayan formado burbujas de aire entre el gel y la membrana. Sumerja el sándwich en tampón de transferencia y aplique un campo eléctrico.
Las proteínas con carga negativa migrarán hacia el electrodo con carga positiva. Luego, la membrana las detiene, se une a ellas y evita que continúen avanzando. Una vez completada la transferencia, visualice las proteínas para asegurar una transferencia uniforme y ausencia de bolsas de aire.
Esto puede hacerse fácilmente con el tinte rojo para inmunotransferencia. Este tinte está listo para usar y la descoloración puede realizarse fácilmente con agua. Este es el gel una vez que ha sido descolorido mediante lavados con agua; antes de que la membrana pueda ser probada con anticuerpo, la membrana se bloquea.
Para evitar la unión inespecífica, bloquee la membrana con reactivos de bloqueo de alta calidad. Para evitar un aumento del fondo, incube la membrana en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave, luego lave la membrana tres veces en TBST o PBST tras la incubación. Estos tampones pueden prepararse fácilmente y de forma conveniente utilizando tabletas de TBS tween y tabletas de PBS tween, respectivamente.
Una vez que la membrana haya sido bloqueada y lavada, puede incubarse con el anticuerpo primario. Aplique el anticuerpo primario utilizando la solución uno de señal potenciada, que permite mejorar significativamente la señal. Prepare el anticuerpo primario en la solución uno e incube la membrana durante una hora.
No es necesario añadir agentes bloqueantes adicionales tras la incubación. Lave la membrana con TBST. A continuación, incube la membrana con el anticuerpo secundario diluido en la solución dos del potenciador de señal durante una hora.
Finalmente, lave nuevamente la membrana varias veces con TBST para la detección de anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Aquí se utiliza tradicionalmente la detección mediante quimioluminiscencia mejorada o ECL. Se emplea el reactivo ECL de paso rápido, ya que no requiere mezclar luminol ni potenciador.
Simplemente rocíe la membrana varias veces, incube durante dos minutos y revele utilizando una película de rayos X. Rapid Step ofrece una sensibilidad de bajo picogramo, así como una emisión más ligera durante hasta dos horas después de la adición del sustrato. Los marcadores proteicos Trail mix permiten el seguimiento de las proteínas durante la electroforesis en comparación con los protocolos estándar de inmunotransferencia.
Signal Boost permite un mayor rango dinámico y sensibilidad. Finalmente, se puede obtener una sensibilidad superior utilizando el paso Rápido en lugar de los reveladores ECL tradicionales. Acabamos de mostrarle cómo realizar el ensayo Western blot de manera eficiente y rentable con una amplia gama de productos.
Recuerde que la calidad de sus resultados depende de la calidad de sus reactivos. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
Resumen
Este artículo demuestra la técnica de inmunotransferencia, un método esencial para detectar proteínas específicas en muestras de tejido. El procedimiento destaca la importancia de utilizar reactivos de alta calidad y protocolos adecuados para obtener resultados óptimos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Análisis de proteínas
- Técnicas analíticas
Antecedentes
- La transferencia Western es una técnica analítica ampliamente utilizada.
- Permite la detección y cuantificación de proteínas específicas.
- La técnica comprende varios pasos, incluyendo la preparación de muestras, electroforesis en gel y transferencia a una membrana.
- Los reactivos y protocolos adecuados son cruciales para obtener resultados exitosos.
Objetivo del estudio
- Demostrar el procedimiento de inmunotransferencia (Western blotting).
- Enfatizar la importancia de la calidad de los reactivos para obtener resultados confiables.
- Proporcionar una guía paso a paso para investigadores.
Métodos Utilizados
- Preparación de muestras mediante centrifugación y reactivos de extracción de proteínas.
- Desnaturalización de proteínas con SDS y carga en un gel.
- Electroforesis para separar proteínas según su peso molecular.
- Transferencia de proteínas a una membrana seguida de detección con anticuerpos.
Resultados principales
- Se logró una separación y transferencia exitosas de proteínas.
- Se demostraron eficazmente los pasos de bloqueo y sondado.
- Se observó una sensibilidad de detección mejorada mediante el uso de reactivos específicos.
- Se obtuvo una visualización clara de las proteínas utilizando métodos de detección por ECL.
Conclusiones
- La transferencia Western puede realizarse de manera eficiente con los protocolos adecuados.
- La calidad de los reactivos afecta significativamente los resultados.
- Esta técnica sigue siendo una herramienta fundamental en el análisis de proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transferencia Western es un método fundamental de detección de proteínas que sustenta la validación de dianas y los estudios mecanicistas en la investigación y desarrollo biofarmacéutico&Sus resultados cuantitativos y la especificidad basada en anticuerpos permiten una evaluación confiable de la expresión proteica, la modulación de vías y la presencia de biomarcadores en flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos. Un inmunotransferencia fiable respalda la toma de decisiones predictiva y el avance de carteras ajustado al riesgo.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de dianas proteicas y componentes de vías en muestras biológicas.
- Apoya la validación funcional de dianas candidatas mediante la detección cuantitativa de proteínas.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al confirmar la modulación de los puntos finales moleculares previstos.
- Proporciona evidencia reproducible de la interacción con la diana y la especificidad de la vía.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona sistemas validados de detección de proteínas para cribado posterior y evaluación de compuestos.
- Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante protocolos y controles definidos.
- Apoya la medición cuantitativa de la abundancia proteica para análisis comparativos.
- Prepara plataformas robustas para cribado escalable e integración de datos entre estudios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la detección de proteínas con biomarcadores relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica al confirmar la modulación proteica en modelos pertinentes.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles sobre proteínas.
- Permite obtener información mecanicista sobre los efectos de los compuestos y las vías biológicas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El inmunoblot o western blot integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de fármacos candidatos y la validación preclínica, proporcionando una capacidad analítica reutilizable a lo largo del R&D continuo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar dianas proteicas y efectores descendentes.
- Selección: Proporciona detección de proteínas lista para ensayos y reproducible para la evaluación de compuestos y la confirmación de resultados positivos.
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas y confirmación del peso molecular para análisis comparativos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Alinea la detección de proteínas con modelos de enfermedades y estrategias de biomarcadores cuando el flujo de trabajo lo permite.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y escalable para el análisis de proteínas en múltiples programas y equipos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Permite flujos de trabajo estandarizados, reproducibles y escalables para la detección de proteínas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos robustos sobre proteínas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en descubrimiento y preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la extracción de proteínas, electroforesis y detección basada en anticuerpos.
- Necesita acceso a equipos de electroforesis, transferencia e imagen quimioluminiscente.
- Exige la estandarización entre equipos de protocolos, reactivos y controles para garantizar la reproducibilidad.
- Puede requerir la adaptación de protocolos para diferentes tipos de muestras o sistemas modelo.
- Depende de la especificidad de los anticuerpos y de la calidad de los reactivos para obtener resultados óptimos.
