Páncreas murino aislamiento Islet

Hola, soy Greg Zott. Trabajo en el Centro de Diabetes de la UCSF, en el Laboratorio Bluestone, y hoy les mostraré el proceso para aislar islotes pancreáticos de ratón. El procedimiento consiste en la inyección de una solución de colagenasa en el páncreas de un ratón donante C3H, luego extraeremos ese páncreas, lo digeriremos, purificaremos los islotes mediante un gradiente de Ficoll, y finalmente los seleccionaremos manualmente para su trasplante definitivo en la cápsula renal de un ratón NOD diabético, que será nuestro receptor.

Antes de comenzar este procedimiento, diluimos nuestra solución de ATE en un tampón Hanks modificado y ajustamos la concentración específica para la cepa de ratón que estamos utilizando, la C3H. Encontramos una mejor digestión con una solución de colagenasa de 0,8 mg por ml, y utilizaremos esta solución para inyectar en el conducto biliar común con el fin de distender el páncreas. Realizando el procedimiento hoy estará Pavo Codre del centro de diabetes. Él realizará la inyección, abrirá al ratón, expondrá los intestinos y luego inyectará en el conducto biliar común.

Vamos a rociar al ratón con etanol para mantener el pelo aplanado, y luego también verificaremos que el ratón haya sido sacrificado adecuadamente mediante un pellizco en el dedo del pie. Pavo abrirá ahora al ratón y expondrá el intestino y el páncreas mediante una incisión media. También se cortará el diafragma para verificar que el ratón haya sido sacrificado.

Antes de comenzar, me gustaría señalar algunas de las estructuras importantes. El estómago se encuentra justo aquí, con el páncreas adherido por debajo hacia el duodeno y por encima. Este es el hígado, donde encontraremos la vesícula biliar y el conducto biliar común, que pueden verse justo aquí.

Lo que hará Pavo a continuación es aislar el intestino delgado y localizar el punto en el que el conducto biliar común ingresa al intestino delgado. Una vez expuesto el intestino, colocamos pinzas hemostáticas pequeñas (pinzas de mosquito) en ambos lados del conducto biliar común. Hemos encontrado que esto permite que entren más colagenasas al páncreas, mientras que otros grupos intentan colocar la pinza directamente sobre el conducto biliar común.

Consideramos que esta es una técnica mejor para permitir que la enzima entre en el páncreas. Este es un procedimiento suave. No desea desgarrar el intestino.

Debe permitir que las pinzas se coloquen suavemente a ambos lados del conducto biliar común. Ahora localizaremos una vesícula biliar, y una vez expuesta la vesícula biliar, la usaremos como guía para inyectar la colagenasa en el conducto biliar común. Powell está utilizando una aguja de calibre 30 con una jeringa de cinco cc que contiene tres mililitros de solución de colagenasa.

Mientras entra en el conducto biliar común, distiende dicho conducto con solución de colagenasa y luego avanza por el conducto biliar común hasta llegar cerca del intestino. Y mientras desciende, se bombea la solución enzimática inyectada hacia el páncreas. Ahora que el páncreas está inflamado con la solución de colagenasa, Powell retirará los hemostatos y luego extraerá el páncreas del ratón, separándolo cuidadosamente del intestino.

Él lo extrae del estómago. Bien, y luego, utilizando el bazo como asa, levanta el páncreas y después lo corta lentamente en el conducto biliar común, y eso es todo. El páncreas queda expuesto y luego se elimina el bazo, y allí está eliminando el tejido mesentérico, y a continuación el páncreas se coloca en una solución de colagenasa 2 milimolar en un vial de vidrio esterilizado y se vuelve a colocar sobre hielo.

El páncreas aislado que colocamos en los viales de vidrio se colocará ahora en un baño de agua a 37 grados durante aproximadamente 17 minutos. Los colocamos en un soporte cónico de 50 ml para que no floten. Una vez iniciado el baño, se pone en marcha el temporizador y comienza la digestión.

Una vez finalizado el tiempo de digestión, se retiran los viales y luego se agitan y desintegran suavemente. Y cuando el tejido comienza a deshacerse, el vial se coloca entonces sobre hielo. Se coloca una malla estéril sobre un vaso de precipitados de 400 mil que contiene tampón de lavado.

El digesto de páncreas se vierte cuidadosamente sobre la malla dentro del tampón de lavado. A fines de demostración, se ha apagado la campana extractora y se ha elevado el cristal de la campana para que podamos ver lo que estamos haciendo. Una vez que el digesto de páncreas se ha vertido en el vaso de precipitados, los viales se enjuagan con el mismo tampón de lavado y el tampón de lavado se coloca sobre la malla.

Tenemos una jeringa llena con tampón de lavado. La usaremos para lavar enérgicamente el tejido a través del tamiz. La idea consiste en liberar cualquier botón suelto que no esté unido a la matriz, dejando las membranas y el tejido no digerido sobre el tamiz.

Y cuando se termina de lavar un tejido, esto es lo que normalmente se observa al final del procedimiento. El tejido de páncreas que se encuentra en el fondo del tubo se transferirá ahora a dos tubos cónicos de 50 ml, el tejido se lavará, se mezclará uniformemente y luego se distribuirá de manera homogénea para obtener un volumen de pellet igual en cada tubo. Ahora se enjuaga el vaso de precipitados con más tampón de lavado.

Los laterales se enjuagan para recuperar todo el tejido que haya entrado en el vaso de precipitados. Luego se distribuye equitativamente entre los dos tubos, 50 ml en cada uno. A continuación, se completan hasta el volumen con tampón de lavado.

El tejido se invierte varias veces y luego se coloca en una centrífuga. Este es un breve centrifugado. Se permite que la centrífuga alcance mil RPM y luego se apaga.

El tejido en este momento es muy sensible y los orificios son muy delicados, por lo que no debe comprimirlos en exceso. Se retiran los tubos y se realizará este paso de lavado otras tres veces. Este es el final del tercer lavado.

Los componentes del tubo cónico de 50 ml se transfieren al tubo cónico de 15 ml y se centrifugan a mil RPM, luego se detienen. Se eliminará el sobrenadante y se iniciará la primera parte de la FI Call. Estamos en el paso en el que tenemos nuestro digesto de páncreas pelado.

Re-suspenderemos ese tejido para que quede bien suelto respecto a los pellet. Añadiremos el primer gradiente de densidad, que es 1 1 0 8. Añadiremos cinco mililitros a cada tubo.

El sedimento luego se mezcla cuidadosamente en cada uno de los gradientes. Es importante que obtenga una buena distribución del tejido en su gradiente más denso. Ahora vamos a superponer dos mililitros de densidad 1 0 9 6.

Luego, encima de eso, colocaremos dos mils de densidad 1 0 6 9, y encima de eso, densidad 1 0 3 7. Es importante que, mientras se colocan las densidades, no se mezclen. Entonces, todas las capas han sido añadidas al tubo.

Y puede observarse que esta es la parte superior de 1 1 0 8, la parte superior de 9 1 0 9 6, la parte superior de 1 0 6 9 y la parte superior de 1 0 3 7. Además, se puede ver que el tejido ya está comenzando a desplazarse hacia su densidad adecuada incluso sin centrifugación. Los gradientes de fial se aceleran hasta alcanzar 1800 RPM durante 15 minutos, y recuerde mantener el freno desactivado después de retirar los tubos del centrífugo.

Puede observarse entre la capa 0 0 9 6 y la capa 0 0 7 una buena banda de tejido de islotes de Pablo. Ahora se retira la capa 0 3 7 para eliminar cualquier resto de tejido y ADN que pudiera haberse liberado durante el procesamiento. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico estéril, se retira ahora la capa de islotes y se transfieren a un tubo cónico de 50 ml que contiene 25 ml de tampón de lavado.

Desea realizar este paso rápidamente porque el fol es tóxico para los ocelos. En realidad, eliminamos toda la capa 0 6 9 y 0 9 6. Pavo corta la parte superior de la pipeta de plástico para pastura y la enjuaga con tampón de lavado.

Los orificios se centrifugan entonces como lo hicimos anteriormente. Se aumenta la centrifugadora hasta mil RPM y luego se detiene y se aspira. Los orificios sobrenadantes se lavarán tres veces con medio de lavado.

Así que acabamos de completar el proceso de aislamiento de párpados: pasamos desde la digestión hasta el gradiente de folículos y luego a los ojales purificados. Después de nuestra tercera lavada con tampón de lavado, resuspendimos los ojales en nuestro medio RPMI y los colocamos en una placa de cultivo de tejidos. Estos ojales ya están listos para ensayos in vitro o preparaciones in vivo, como el trasplante de ojales.