Ensayo clonigénicas: las células adherentes

Hola, mi nombre es Lum y actualmente estoy realizando mi doctorado en el Instituto del Corazón y la Diabetes BE IDI bajo la supervisión del Dr. Tom Carianne, quien es el jefe del Laboratorio de Medicina Epigenómica. En este video, demostraré el procedimiento conocido como ensayo de supervivencia clonogénica. Esta es una técnica de 50 años de antigüedad, que permite evaluar el impacto de diferentes tratamientos, como la exposición a radiación o agentes químicos, sobre la viabilidad reproductiva celular.

El ensayo de supervivencia congénico es una técnica fundamental en biología de la radiación para evaluar la sensibilidad a la radiación de diferentes líneas celulares y probar la eficacia de diversos compuestos radioprotectores o radiosensibilizantes. Al utilizar una línea celular adherente, el ensayo de supervivencia criogénico consta de tres fases. Primero, el tratamiento de una monocapa de células adherentes.

En segundo lugar, la preparación de una suspensión de células individuales y la siembra de un número conocido de células en placas marcadas, y en tercer lugar, la tinción, el recuento y las colonias formadas tras un período de incubación. En este video, utilizaré células de linaje inmortalizado de origen humano para demostrar cómo el ensayo de capacidad clonogénica puede emplearse para determinar las propiedades radioprotectoras del antioxidante natural. Se siembran 1225 matraces con células en cinco mililitros de medio previamente, de modo que el día del experimento haya un millón de células por matraz.

Se agregan 50 microlitros del fármaco a diferentes concentraciones a los cinco mililitros de medio en cada matraz debidamente etiquetado para alcanzar la concentración requerida; se utilizan cinco concentraciones, así como un control de vehículo en este caso, PBS. Después de añadir el fármaco, las células se incuban durante una hora en las condiciones adecuadas para la línea celular utilizada. Tras la incubación, los grupos experimentales, excluyendo el grupo control, se irradian a la dosis elegida, que en este caso es cuatro grays producidos por una fuente de cesio emisora de rayos gamma.

Después de la irradiación, se eliminan los medios y cada frasco se lava con dos mililitros de PBS durante cinco minutos. Después de verter el PBS, se añaden dos mililitros de tripsina al 0,05% a cada frasco para desprender las células adherentes A del frasco. Luego se añaden cinco mililitros inferiores de DMEM que contienen suero bovino fetal al 10% a cada frasco para desactivar la tripsina.

A continuación, se transfiere todo el contenido del fascículo a tubos cónicos de 10 mililitros etiquetados. Una vez finalizado, estos tubos se centrifugan durante cinco minutos, tras lo cual se descarta cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento, y se añaden cinco mililitros de medio crecy a cada tubo. Se calcula la concentración de células de cada muestra, así como el volumen necesario de cada muestra para alcanzar la concentración final de células que se sembrarán en cinco placas de Petri por muestra, con cinco mililitros de medio cada una.

Por ejemplo, para el grupo control, se siembran 100 células por placa, por lo que se calcula el volumen necesario para obtener 500 células por 25 mililitros; para muestras más concentradas, realice una dilución 10 veces o una dilución seriada 100 veces para minimizar el error asociado al uso de volúmenes menores a 100 microlitros. Ahora, el volumen previamente calculado se prepara en un tubo Falcon que contiene 25 mililitros de medio para cada muestra. Las muestras ya pueden transferirse a placas previamente etiquetadas, añadiendo cinco mililitros a cada placa para facilitar su manipulación y transporte.

Guarde los cultivos en un recipiente grande, estéril o desinfectado. A continuación, coloque los cultivos en una incubadora humectada en las condiciones adecuadas e incube durante ocho días. Si se van a utilizar queratinocitos después de ocho días, retire cuidadosamente los cultivos de la incubadora y colóquelos uno por uno dentro de una campana extractora.

Tenga cuidado de manipular el lugar con suavidad para no perturbar las colonias que se hayan formado. Retire las tapas y agregue cinco ml de solución salina al 0,9 % a cada placa para lavarlas. Dirija la punta del preparado hacia la esquina de la placa y evite tocar el fondo para no desprender accidentalmente las colonias.

Después de cinco minutos, aspire cuidadosamente la salina. Ahora, las colonias se fijan con tres mililitros de 4%formula, y los tapones deben reemplazarse para evitar la evaporación. Después de 15 minutos a media hora, se aspira y se desecha adecuadamente la formula.

Las colonias ya están listas para ser teñidas con violeta de cristal al 0,1 %; se añaden cinco mililitros a cada placa y las tapas se reponen tras media hora a una hora. El colorante luego se elimina con agua destilada y las placas se invierten y se dejan secar durante la noche. Las colonias ya están listas para ser contadas.

Las colonias pueden contarse manualmente utilizando un microscopio estereoscópico. Cualquier agrupación de células que contenga 50 o más células se considera una colonia. Y eso concluye nuestra demostración del ensayo de supervivencia congénico.

La principal ventaja de este ensayo frente a otras técnicas es que es extremadamente sensible y puede detectar supervivencia en un rango amplio incluso tras una reducción de seis órdenes de magnitud en el número de células. Esta sensibilidad se logra sembrando números mayores de células. Este ensayo puede utilizarse fácilmente para otros fines, como evaluar la citotoxicidad.

Gracias por ver.