iClip - transcriptoma en todo el mapeo de la proteína-ARN interacciones con la Resolución de nucleótidos individuales

El objetivo general del siguiente experimento es obtener un mapa del transcriptoma completo de los sitios de unión de una proteína que se une al ARN, con resolución a nivel de nucleótido individual. Esto se logra mediante la irradiación con luz ultravioleta de células vivas para inducir la reticulación covalente de proteínas y ARN in vivo como segundo paso. La proteína que se une al ARN se purifica mediante inmunoprecipitación bajo condiciones estrictas con el fin de recuperar los fragmentos de ARN reticulados.

A continuación, la transcripción inversa genera ADNc que a menudo se truncan en el péptido unido, lo que conserva la información sobre la posición del entrecruzamiento dentro del ARN. Los resultados obtenidos muestran todos los sitios de unión dentro del transcriptoma, basados en la secuenciación de alto rendimiento de la biblioteca de ADNc. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del ARN, como cómo la interacción de diferentes proteínas unidas al ARN regula el procesamiento del ARN. La principal ventaja de esta técnica es que aumentamos tanto el rendimiento como la resolución de nuestros mapas a escala del transcriptoma de las interacciones proteína-ARN. Para comenzar el procedimiento de entrecruzamiento por UV en células de cultivo tisular.

Retire el medio de una placa de 10 centímetros de células healer. Añada seis mililitros de PBS frío en hielo y coloque las placas sobre hielo. Una placa es suficiente para tres experimentos.

Retire la tapa e irradie las células. Una vez a 254 nanómetros con 150 milijoules por centímetro cuadrado, recupere las células raspándolas de las placas con un elevador celular y transfiera dos mililitros de suspensión celular a cada uno de tres tubos microcentrífugos para obtener el pellet celular. Centrifúgelos a velocidad máxima durante 10 segundos a cuatro grados Celsius.

Luego retire el snap supinado, congele los pellet celulares en hielo seco y almacénelos a menos 80 grados Celsius hasta su uso. Añada 100 microlitros de proteína, un dyna bead por experimento, a un tubo microfresco. Si está trabajando con anticuerpos de ratón o de cabra, utilice dyna beads de proteína G.

Lave las perlas dos veces con tampón de lisis, que se puede encontrar en el protocolo escrito adjunto. Re suspenda las perlas en 100 microlitros de tampón de lisis con dos a 10 microgramos de anticuerpo. Incube el tubo en rotación a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos.

Luego, lave las perlas tres veces con 900 microlitros de tampón de lisis y déjelas en el último lavado hasta que esté listo para continuar. Para la inmunoprecipitación, mantenga la célula Thor palace en hielo. Resuspenda en un mililitro de tampón de lisis y transfiera a un tubo micro de 1,5 mililitros.

Prepare una dilución de uno a 500 del ARN uno. Luego agregue 10 microlitros junto con dos microlitros de ADNasa turbo al lisado celular. Incube las muestras exactamente durante tres minutos a 37 grados Celsius, agitando a 1.100 rotaciones por minuto, y transfiera inmediatamente a hielo.

Luego, centrifugue las muestras a cuatro grados Celsius y 22.000 ×g durante 20 minutos para aclarar el lisado; recoja cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 microlitros de lisado con el precipitado para inmunoprecipitar las perlas. Elimine el tampón de lavado y luego agregue los lisados celulares preparados. Incube las muestras en rotación durante dos horas a cuatro grados Celsius.

Deseche el agente SUP y lave las perlas dos veces con 900 microlitros de tampón de alta salinidad, que se encuentra en el protocolo escrito adjunto. Finalmente, lave las perlas dos veces con 900 microlitros de tampón de lavado. A continuación, proceda a desfosforilar y añadir un conector a los extremos tres primos del ARN.

Para etiquetar los extremos cinco primarios del ARN trabajando detrás de un escudo de plexiglás. Retire el sobrenadante de la última lavada de la reacción de ligación del conector y resuspenda los perlas en ocho microlitros de mezcla caliente de PNK. Incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius.

Retire la mezcla caliente de PNK y reus. Suspenda las perlas en 20 microlitros de tampón de carga nuevo al 1×. Luego incube la muestra en un mezclador térmico a 70 grados Celsius durante 10 minutos.

Coloque inmediatamente la muestra sobre un imán para precipitar las perlas vacías. Cargue las muestras en un gel Bis-Page nuevo del 4 al 12 % según las instrucciones del fabricante.

Además, cargue cinco microlitros de un marcador de tamaño de proteínas precargado. Corra el gel durante 50 minutos a 180 voltios. Transfiera los complejos de proteína y ARN desde el gel a una membrana de nitrocelulosa utilizando el aparato de transferencia húmeda NOVA según las instrucciones del fabricante.

Después de la transferencia, lave la membrana con tampón PBS. Luego envuélvala en papel de plástico y expóngala a una película a menos 80 grados Celsius. Realice exposiciones durante 30 minutos, una hora y toda la noche.

A continuación, aísle la región de la membrana que contiene los complejos proteína-RNA a partir de los ARN de bajo peso molecular. Realice el experimento utilizando la autorradiografía como máscara. Recupere el ARN de la membrana mediante digestión con proteinasa K y extracción con fenol-cloroformo.

Transcriba inversamente el ARN utilizando uno de los cebadores AYP para purificar el ADNc en gel. Mezcle seis microlitros de la muestra de ADNc con seis microlitros de tampón de carga de urea TBE al doble de concentración. Justo antes de cargar las muestras en un gel.

Caliente las muestras a 80 grados Celsius durante tres minutos. Luego cargue las muestras en un gel de urea TBE al 6% precolado junto con un marcador de peso molecular bajo. Deje correr el gel durante 40 minutos a 180 voltios según lo descrito por el fabricante, utilizando el tinte superior y las marcas en el soporte plástico del gel como guía para la escisión.

Corte tres bandas de 120 a 200 nucleótidos, 85 a 120 nucleótidos y 70 a 85 nucleótidos. Tenga en cuenta que el cebador arc lip y la secuencia L tres juntos representan 52 nucleótidos de la secuencia clip. Añada 400 microlitros de TE y triture el trozo de gel en pequeños fragmentos.

Incubar los trozos de gel con agitación a 1.100 rotaciones por minuto durante dos horas a 37 grados Celsius utilizando el émbolo de una jeringa de un mililitro. Colocar dos prefiltros de vidrio de un centímetro en una columna CoStar SpinX. Transferir la porción líquida de la muestra a la columna y centrifugar durante un minuto a 13.000 rotaciones por minuto en un tubo de 1,5 mililitros.

Añada 0,5 microlitros de glyco blue y 40 microlitros de acetato de sodio pH 5,5. Luego mezcle la muestra. Añada un mililitro de etanol al 100 %.

Vuelva a mezclar y precipite la muestra durante la noche a veinte grados Celsius bajo cero. Finalmente, circularice las moléculas de ADNc para unir la región adaptadora al extremo cinco prima. A continuación, vuelva a linearizar y amplifique por PCR según el protocolo escrito adjunto antes de la secuenciación de la biblioteca de clips oculares; el éxito del experimento se puede monitorear en dos pasos.

El autorradiográfico del complejo proteína-RNA tras la transferencia a membrana y la imagen de gel de los productos de PCR en el autorradiográfico de las muestras con bajo contenido de ARN; en muestras con alto contenido de ARN, debe observarse una radioactividad difusa por encima del peso molecular de la proteína. Esta radioactividad se concentra más cerca del peso molecular de la proteína. Cuando no se utiliza ningún anticuerpo en la inmunoprecipitación, no se debería detectar ninguna señal.

Controles adicionales importantes para la especificidad de la inmunoprecipitación consisten en emitir irradiación UVE o utilizar células que no expresen la proteína de interés. La imagen del gel de los productos de PCR debe demostrar un rango de tamaño que corresponda a la fracción de ADNc. Tenga en cuenta que los cebadores de PCR, P tres Celexa y P cinco Celexa, introducen 76 nucleótidos adicionales al tamaño del ADNc. Si no se utiliza ningún anticuerpo durante la inmunoprecipitación, no debería detectarse ningún producto de PCR correspondiente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que cada uno de los 64 pasos es fundamental y debe realizarse con una precisión del cien por ciento. Los datos de ICL pueden integrarse computacionalmente con ensayos funcionales de todo el transcripoma. Esto puede, por ejemplo, proporcionar información sobre la regulación dependiente de la posición del procesamiento del ARN.

Para el análisis computacional de datos, nos gustaría remitirnos a nuestras publicaciones recientes en colaboración con Nicholas KA del Instituto Europeo de Bioinformática y Bla Zupan de la Universidad de Liana. Y ahora es momento de que comience sus propios experimentos. Que lo disfrute.