El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Este procedimiento analiza los efectos de las pequeñas GTPasas sobre el tráfico polarizado de membranas. Primero, coinyecte plásmidos de ADN que codifican la pequeña GTPasa y las proteínas reporteras en los núcleos celulares de células polarizadas. Luego, exprese el ADN a temperaturas que detengan las proteínas reporteras en el retículo endoplásmico o en el TGN, mientras la pequeña GTPasa se acumula en el citosol, y proceda a rastrear la proteína reportera hacia la superficie celular en presencia de cicloheximida para evitar la síntesis de nuevas proteínas.

Finalmente, marque la proteína reportera en la superficie celular para el análisis de inmunofluorescencia. Los resultados obtenidos mediante este ensayo permiten visualizar el cambio en la localización superficial mediante microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección es que, durante los breves periodos de sobreexpresión logrados mediante microinyección, los efectos secundarios son mínimos, lo que nos permite estudiar los efectos primarios de las proteínas de interés.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la polaridad celular, como cómo la gtpasa pequeña regula el tráfico polarizado de membranas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos individuales necesarios para una microinyección exitosa son difíciles de explicar sin ayuda visual. Aísle el ADN plasmídico libre de endotoxinas con el kit maxi prep libre de endotoxinas de Sigma Aldrich según el protocolo del fabricante. Para este experimento, utilice tres filtros transbien transparentes de 12 milímetros y tamaño de poro de 0.4 micrómetros para el cultivo.

Las células se siembran cuatro veces diez a la quinta potencia de células MDCK en cada filtro. Después de dos días, examine el cultivo bajo un microscopio para verificar que las células estén creciendo en una monocapa cerrada. Para microinyección.

El día de la microinyección, prepare placas de 360 por 15 milímetros con cinco litros de medio de crecimiento MM más 15 milimolar de hepes y colóquelas en un incubador a 39 grados Celsius. Además, prepare tres placas de 12 pocillos con un mililitro de medio de crecimiento MEM más 50 milimolar de hepes y 0,1 miligramo por mililitro de cicloheximida, y colóquelas en un incubador a 31 grados Celsius. Encienda el microscopio de microinyección, configurado con este microscopio invertido con platina calefaccionada, objetivos de 10 x y 32 x, y un einor femto jet.

Coloque la platina calefactada a 39 grados Celsius. También abra el suministro del tanque de gas nitrógeno hacia la mesa antivibraciones. Ahora diluya el ADN con agua filtrada hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro.

Posteriormente, centrifugar el ADN en una microcentrífuga einor a 13.000 RPM durante 30 minutos. Retirar la porción superior y colocarla en un tubo nuevo. A continuación, preparar las células MDCK extrayendo el primer filtro de su placa de cultivo con la hoja quirúrgica, cortar el filtro del soporte y colocarlo en la placa preparada de 60 por 15 milímetros que contiene cinco mililitros de medio de crecimiento MEM calentado a 39 grados Celsius más 50 milimolar de hepes.

Para sujetar el filtro en la placa de cultivo, coloque la hoja de bisturí en el centro del filtro y luego transfiera la placa de cultivo a la platina calentada del microscopio. Cargue de dos a tres microlitros del ADN diluido en una aguja de microinyección. Gire la cubierta protectora de la aguja y déjela caer al suelo.

Para colocar la aguja en el soporte, presione la tecla de menú de la inyección y asegúrese de que la válvula esté cerrada. Enrosque la aguja en su soporte. Tenga cuidado de no apretar demasiado la aguja.

Como esto podría provocar una rotura, presione nuevamente la tecla de menú. De este modo, la presión de compensación aplicada evitará que el medio sea succionado hacia la aguja durante el procedimiento de microinyección. Finalmente, pulse el joystick para borrar la posición de referencia almacenada y bajar la aguja sobre las células.

Utilice el objetivo de 10x y coloque la aguja en el haz de luz por encima del líquido. Enfoque ahora las células. Enfoque hacia arriba nuevamente girando la rueda de enfoque 180 grados hacia arriba y localice la aguja.

Mueva lentamente la aguja hasta enfocarla. Luego, desenfóquela nuevamente. Trabaje para volver a enfocar las células.

Baje nuevamente la aguja hasta enfocarla. Repita hasta que la aguja toque la superficie del medio, momento en el cual se observará un halo. Continúe hasta alcanzar el punto en que las células estén enfocadas, pero la aguja aún esté borrosa fuera del plano focal.

Ahora cambie al objetivo de 32 x y encuentre los ajustes generales. Establezca el límite Z tocando la membrana apical con la punta de la aguja y restando aproximadamente 10 micrómetros, ya que los núcleos se encuentran a unos 10 micrómetros por debajo de la membrana apical.

Ahora saque la aguja unos pocos micrones del plano focal lo más rápido posible. Apunte con la aguja por encima del núcleo y presione y suelte el botón de inyección del joystick. Comience con 95 PSI para encontrar la presión de inyección adecuada.

Si la presión es demasiado alta, las células estallan. Si la presión es demasiado baja, persiste un punto blanco, pero no ocurre nada más. Realice una inyección exitosa que implique un cambio de fase sin un cambio en el tamaño celular.

Inyecte de 100 a 500 células dentro del orificio de la hoja quirúrgica que se encuentra sobre las células. Luego, coloque las células junto con la placa de cultivo y la hoja quirúrgica en un incubador a 39 grados Celsius y incube durante dos horas. Finalmente, transfiera las células a la placa de 12 pocillos preparada con un mililitro de MEM más 50 milimolar 0,1 miligramo por mililitro de cicloheida e incube durante dos horas a 31 grados Celsius.

Para evitar el blanqueo de la señal de GFP expresada, proteja las muestras de la luz cubriéndolas con papel de aluminio durante todos los procedimientos posteriores de tinción de superficie. Coloque las células en una placa de cultivo sobre una placa metálica con hielo y lávelas. Una vez con PBS frío más más, coloque un trozo limpio de paraform sobre la placa metálica con hielo y agregue gotas de 30 microlitros de un anticuerpo que reconozca el dominio ectópico de la proteína de interés mediante pipeta.

Ahora coloque el filtro que contiene las células boca abajo sobre la gota y agregue unas gotas de anticuerpo en la parte posterior del filtro. Incube durante una hora en hielo. Lave las células tres veces con PBS frío con hielo más más y fije con paraformaldehído al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Proceda a lavar las células una vez con PBS más más y equilibrar en PBS más más durante cinco minutos. Incube ahora las células en tampón bloqueante permeabilizante. Incube una hora a temperatura ambiente, diluya los anticuerpos primarios uno a 200 en BPB para detectar la RAB GTP ASA expresada, centrifugue durante 10 minutos a 13.000 RPM, pipetee 30 microlitros de la solución de anticuerpos sobre un parafilm limpio colocado en una cámara húmeda.

Coloque las células sobre el filtro boca abajo sobre las gotas de anticuerpo e incube durante una hora. A temperatura ambiente, coloque nuevamente las células en posición normal hacia arriba en una placa de 12 pocillos y lave cinco veces durante 30 minutos con BPB a temperatura ambiente después de la incubación con los anticuerpos secundarios apropiados, incluyendo un paso de lavado.

Sumerja las células en el filtro tres veces en agua desionizada y colóquelas con el lado derecho hacia arriba sobre portaobjetos con 10 microlitros de medio de montaje. Coloque un cubreobjetos micro de 18 por 18 milímetros encima y, utilizando pañuelos faciales, presione suavemente el cubreobjetos sobre las células. Finalmente, selle con esmalte de uñas en la inyección simulada solo del plásmido que codifica V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. La proteína se entrega a la superficie basolateral de células MDCK bien polarizadas, según lo indicado por la tinción superficial roja en células que no están bien polarizadas.

Alguna parte de la proteína de fusión GFP será transportada a la membrana apical. Si las muestras de control presentan este aspecto, los datos no son confiables y el experimento debe repetirse con células mejor polarizadas. Tenga en cuenta que no toda la proteína de fusión expresada hacia GFP es transportada a la membrana basolateral durante el período de seguimiento a 31 grados Celsius, como lo demuestra la intensa señal verde intracelular para la proteína total. Una vez dominada, esta técnica debería llevar aproximadamente de 10 a 12 horas tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico de membranas exploraran proteínas reguladoras en células epiteliales polarizadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar proteínas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.