Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus
20 de abril de 2011
Una partícula desarrollado recientemente la novela de aglutinación (PA) de ensayo utilizando virus molécula del receptor permite una identificación rápida y fácil de poliovirus (PV). En este artículo vamos a mostrar el procedimiento para el ensayo de PA para la identificación de PV.
El objetivo general del siguiente procedimiento es identificar rápidamente aislamientos de virus de la poliomielitis mediante un protocolo sencillo. Para este ensayo, utilizamos partículas de gelatina sensibilizadas recubiertas con moléculas quiméricas que contienen el dominio extracelular del receptor humano del virus de la poliomielitis unido al fragmento fc de IgG2. Dado que estas partículas tienen una afinidad uniforme por todos los serotipos de aislamientos del virus de la poliomielitis, se produce aglutinación de las partículas tras la incubación con muestras que contienen cualquier virus de la poliomielitis humano.
Sin embargo, si están presentes anticuerpos capaces de reconocer el aislado viral específico de la muestra, ocurre la neutralización y se evita la aglutinación; mediante este sistema experimental, se puede realizar la identificación rápida de aislados de poliovirus en una sola reacción. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la prueba convencional de neutralización, es la simplicidad de la SIM en cuanto al procedimiento y a la interpretación, con el fin de reducir la mano de obra requerida y acortar el tiempo necesario para obtener los resultados. Para reconstituir los anticuerpos anti PV uno, PV dos y PV tres, añada 0.5 mililitros de agua a cada vial.
Luego, transfiera cada solución de anticuerpo a tubos separados que contengan 4,5 mililitros de medio de mantenimiento. Algunos lotes de anticuerpo anti PV se proporcionan en forma reconstituida; para estos lotes de anticuerpo anti PV, no es necesario añadir agua para la reconstitución.
A continuación, prepare mezclas uno a uno de la solución combinada de anticuerpos con un volumen final de 3,6 mililitros en tubos frescos etiquetados. Por ejemplo, mezcle 1,8 mililitros de anti PV uno con 1,8 mililitros de anti PV dos. Para preparar una combinación de anti PV uno más PV dos, repita esto para cada combinación por pares posible y también prepare una solución que contenga los tres tipos de anticuerpos mezclando 1,2 mililitros de cada antisuero.
Una vez que se hayan preparado las cuatro mezclas con 720 microlitros de suero bovino fetal en cada solución de anticuerpos. Esto ayudará a reducir la aglutinación no específica de las partículas de gelatina por los anticuerpos durante el ensayo. Los grupos de anticuerpos pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta que se utilicen en el ensayo de aglutinación.
En este ensayo, utilizamos partículas de gelatina liofilizadas que han sido recubiertas con los dominios extracelulares del receptor humano del virus de la poliomielitis y de IgG dos dominios FC de ratón. Asegúrese de usar un solo lote de partículas y no lotes diferentes en un mismo experimento para garantizar la consistencia de la imagen de aglutinación; reconstituya las partículas con 1,5 mililitros de tampón de reconstitución por vial. Agite suavemente para mezclar bien.
Las partículas reconstituidas pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta dos semanas. Primero, diseñe su experimento en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Para cada muestra, el pocillo número uno contendrá solo virus.
Los pozos del dos al cinco contendrán el virus más una de las cuatro soluciones mezcladas de anticuerpos. Asegúrese de reservar un pozo para un control negativo que contenga solo medio, sin virus ni anticuerpos. Una vez que la placa haya sido preparada, agregue 12 microlitros de la solución de anticuerpos correspondiente a cada pozo de las filas dos a cinco y 12 microlitros de medio de crecimiento.
Medio al virus solo, pozos en la fila uno y al pozo de control negativo en la fila seis. A continuación, agregue 12 microlitros de muestra de virus en las primeras cinco filas y 12 microlitros de medio de crecimiento al pozo de control negativo en la fila seis. Una vez que se hayan sembrado los anticuerpos y el virus, resuspenda, suspenda las partículas de gelatina reconstituidas golpeándolas suavemente e inmediatamente agregue 25 microlitros de partículas por pozo a todos los pozos.
Es importante no permitir que las partículas se sedimenten antes de transferirlas a la placa, con el fin de obtener cantidades iguales de partículas en cada pocillo. Coloque la placa de ensayo sobre un mezclador de placas y mezcle durante 30 segundos. Luego, coloque la placa sobre una hoja de papel blanco e incube la placa a temperatura ambiente durante dos horas para permitir que ocurra la aglutinación.
Es importante no mover la placa en ningún momento durante ni después de la incubación, ya que la aglutinación formada es inestable. Una vez que la reacción haya ocurrido, tome varias fotografías de la placa en las que se pueda apreciar la calidad de la aglutinación en cada pocillo. En los pocillos donde no ha ocurrido aglutinación, como se muestra aquí a la izquierda, las partículas de gelatina coloreada precipitarán en el fondo del pocillo; en aquellos donde sí ha ocurrido aglutinación, no lo harán.
Debido a la interacción entre el virus y las partículas de gelatina recubiertas con IgG dos A, se observa un patrón coloreado difuso como se muestra en el centro. En este experimento, evaluamos la capacidad de soluciones virales, PV uno, dos y tres, para inducir glu en presencia del anticuerpo. Como se indica aquí, en ausencia de virus o anticuerpos, no ocurre aglutinación y las partículas de gelatina precipitan; en contraste, en el pocillo que contiene virus pero sin anticuerpos.
Ha ocurrido aglutinación debido a la interacción del virus. Con las partículas de gelatina recubiertas con IgG de PVR en los pocillos experimentales, se evita la aglutinación de los virus en cualquier pocillo que contenga anticuerpos que neutralicen específicamente a ese virus. Por ejemplo, se evita la aglutinación del poliovirus tipo uno en los pocillos que contienen anticuerpos anti-PV uno, pero no en los pocillos que contienen únicamente anticuerpos anti-PV dos y anti-PV tres.
Lo mismo es cierto para los tipos dos y tres del poliovirus. Aunque requiere dominio, esta técnica puede realizarse en tan solo tres horas si se lleva a cabo correctamente.
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Resumen
Este artículo presenta un nuevo ensayo de aglutinación de partículas (PA) para la identificación rápida de aislamientos de poliovirus (PV). El método utiliza partículas de gelatina sensibilizadas recubiertas con moléculas quiméricas para facilitar un proceso de identificación sencillo y eficiente.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Métodos diagnósticos
- Inmunología
Antecedentes
- El poliovirus es un problema importante de salud pública.
- Los métodos tradicionales para la identificación del PV pueden ser intensivos en mano de obra y consumir mucho tiempo.
- Se necesitan técnicas novedosas para agilizar el proceso de identificación.
- El ensayo PA ofrece una alternativa más sencilla frente a las pruebas convencionales de neutralización.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de identificación rápida para aislamientos de poliovirus.
- Simplificar el procedimiento y la interpretación de los resultados.
- Reducir la mano de obra y acelerar el tiempo necesario para obtener los resultados.
Métodos Utilizados
- Uso de partículas de gelatina sensibilizadas recubiertas con moléculas quiméricas.
- Incubación de las partículas con muestras que contienen poliovirus.
- Observación de aglutinación para indicar la presencia de poliovirus.
- Neutralización de la aglutinación por anticuerpos específicos si están presentes.
Resultados principales
- El ensayo PA identifica con éxito aislamientos de poliovirus en una reacción de un solo paso.
- Los resultados demuestran afinidad uniforme para todos los serotipos del poliovirus.
- El método es sencillo y fácil de interpretar.
- Reducción significativa del tiempo y la mano de obra en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El nuevo ensayo PA es una herramienta eficaz para la identificación rápida del poliovirus.
- Este método mejora la eficiencia en el diagnóstico virológico.
- Estudios futuros podrían ampliar su aplicación a otros patógenos virales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación rápida y confiable de aislamientos de poliovirus es fundamental para los esfuerzos mundiales de erradicación y la respuesta a brotes. El ensayo de aglutinación de partículas proporciona un método simplificado con lectura visual que reduce la dependencia del cultivo celular y de las técnicas moleculares, permitiendo una toma de decisiones más ágil en los laboratorios de diagnóstico. Este enfoque apoya la confirmación inicial del blanco y las necesidades de desarrollo de ensayos en la investigación antiviral.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la especificidad de la interacción virus-receptor entre los serotipos del poliovirus.
- Valor operativo: Utiliza un formato de reacción de un solo paso compatible con flujos de trabajo de cribado de alto rendimiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de aglutinación que se correlacionan con la presencia viral y el estado de neutralización.
- Valor operativo: Proporciona resultados en menos de dos horas, lo que permite un rápido procesamiento del ensayo y una optimización iterativa.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar compuestos antivirales que bloquean la unión del virus al receptor.
- Valor operativo: Requiere un instrumental mínimo, lo que facilita su implementación en entornos de pruebas con recursos limitados o descentralizados.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la confirmación inicial de los compuestos activos y el seguimiento mecanicista antes de las etapas de optimización del fármaco líder.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos de interacción virus-huésped mediante la observación directa de la inhibición de aglutinación.
- Selección: Permite la selección estandarizada y reproducible de bibliotecas de anticuerpos o compuestos para detectar actividad de neutralización.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos visuales o basados en imágenes que permiten comparar condiciones de inhibición entre muestras.
- Investigación Traslacional: Se conecta con la evaluación preclínica al identificar candidatos que interrumpen la unión al receptor del poliovirus.
- Reutilización Empresarial: La plataforma puede adaptarse para otros patógenos virales sustituyendo partículas recubiertas con receptores, lo que favorece una amplia reutilización del ensayo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al confirmar unión uniforme del receptor entre serotipos.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de mantenimiento de cultivos celulares y capacitación especializada, reduciendo la complejidad operativa.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción en campañas de cribado antiviral al proporcionar datos funcionales rápidos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en perfiles de neutralización específicos del mecanismo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en virología y diseño de inmunoensayos para la preparación adecuada de reactivos y controles.
- Depende del suministro constante de partículas de gelatina recubiertas con receptores y reactivos de anticuerpos.
- Necesita protocolos estandarizados de incubación y adquisición de imágenes para garantizar una puntuación reproducible de la aglutinación.
- Debe tener en cuenta la posible aglutinación no específica debida a componentes de la matriz de la muestra.
- Se limita a virus con ligandos de receptor conocidos; su aplicabilidad depende de la disponibilidad de moléculas de recubrimiento quiméricas adecuadas.
