La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

El objetivo general de este procedimiento es transformar células de levadura con una biblioteca de matriz de ADN plasmídico. Esto se logra primero cultivando una cantidad adecuada de células de levadura. Luego, las células de levadura se tratan con acetato de litio para hacerlas competentes para la transformación de ADN.

A continuación, transforme las células competentes e mezclándolas con ADN. El paso final del procedimiento consiste en seleccionar y analizar los transformantes. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren los efectos del ADN plasmídico sobre los fenotipos de levadura mediante ensayos de siembra en placas y/o microscopía.

La principal ventaja de esta técnica frente a los protocolos existentes, como las transformaciones estándar de levaduras, es que permite la transformación de un gran número de plásmidos diferentes en células de levadura de forma automatizada. Este protocolo de transformación de levaduras de alto rendimiento está diseñado para 10 placas de 96 pocillos, pero puede escalarse hacia arriba o hacia abajo según sea necesario. Para experimentos a mayor escala, la clave del éxito consiste en mantener organizadas todas las placas y los reactivos.

Una vez que el experimento esté en marcha para evitar confusiones, se utilizará un manipulador de líquidos en placas rápido Biobot en este protocolo. Para comenzar, alícuota de cinco a diez microlitros de ADN plasmídico de una biblioteca de plásmidos de levadura en matriz en cada pocillo de placas redondas de 96 pocillos con fondo. Coloque las placas de 96 pocillos descubiertas dentro de una campana de flujo laminar limpia durante la noche para secarlas.

A continuación, inocule 200 mililitros de medio de peptona de levadura y dextrosa o medio YPD con una cepa de interés en un matraz Lin Meyer con aletas de 500 mililitros e incube durante la noche a 30 grados Celsius con agitación. A la mañana siguiente, diluya la cepa de interés hasta una DO600 de 0,1 en dos litros de medio YPD para un crecimiento óptimo. Incube cultivos de hasta un litro en matraces con aletas separados de 2,8 litros.

Agite los frascos durante cuatro a seis horas a 30 grados Celsius hasta que los cultivos alcancen una DO 600 de 0,8 a 1,0. Cuando el cultivo de levadura haya alcanzado una DO 600 de 0,8 a 1,0, recolecte las células por centrifugación. Llene cuatro tubos cónicos desechables de 225 mililitros con cultivo y centrifugue a 3000 RPM durante cinco minutos en una centrífuga de mesa.

Vierta el sobrenadante S de cada tubo. Añada más cultivo a los mismos tubos y centrifugue nuevamente, repitiendo según sea necesario hasta que todas las células sean recolectadas. Lave cada pellet celular con 50 mililitros de agua destilada autoclave y resuspenda mediante vortex.

Combine las células en un tubo cónico de doscientos veinticinco mililitros y centrifugue a 3000 RPM durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante S, lave las células con cien mililitros de solución de acetato de litio. Vuelva a centrifugar a 3000 RPM durante cinco minutos.

Retire el SNA y resuspenda el botón celular en 70 mililitros de solución de acetato de litio. Vortexee a alta velocidad durante aproximadamente 30 segundos hasta que el botón esté completamente resuspendido. Incube con agitación a 30 grados Celsius durante 30 minutos.

A continuación, agregue etanol beta me capto hasta alcanzar una concentración de 0,1 molar e incube con agitación a 30 grados Celsius durante otros 30 minutos. Después de la incubación de 30 minutos, agregue dos mililitros de ADN de esperma de salmón hervido y enfriado a la mezcla celular. Vierta la mezcla celular en una placa de un solo pozo autoclavable y luego elimine cualquier precipitado que se forme, ya que esto podría interferir con las pipetaciones posteriores.

Utilizando el biobot, reparta rápidamente 50 microlitros de la mezcla celular a cada pocillo de las cuatro placas de 96 pocillos previamente preparadas que contienen ADN plasmático; no mezcle. Incube las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación mientras las células están incubando.

Prepare 200 mililitros de solución de acetato de litio PEG DMSO. Combine 160 mililitros de PEG 33 al 50 %, 20 mililitros de DMSO y 20 mililitros de acetato de litio un molar. Es importante que esta solución se prepare inmediatamente antes de su uso.

Añada 125 microlitros de solución de acetato de PEG y litio en DMSO a cada uno. Mezcle bien aspirando y dispensando la suspensión celular ocho veces. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.

A continuación, someta las células a un choque térmico a 42 grados Celsius durante 15 minutos en un incubador seco. No apile las placas después del choque térmico; centrifugue las placas utilizando adaptadores de centrífuga para acomodar placas de 96 pocillos. Después de la centrifugación, elimine la solución de PEG invirtiendo las placas sobre un recipiente de desecho. Luego, seque las placas invertidas sobre toallas de papel.

Para eliminar el líquido residual, las células permanecerán en el fondo de los pocillos. Lave las células añadiendo 200 microlitros de medio mínimo a cada uno. Vuelva a centrifugar las placas.

Elimine el sobrenadante invirtiendo el recipiente sobre un cubo de desecho y absorbiendo con toallas de papel. Añada 200 microlitros de medio mínimo a cada pocillo con una placa rápida e incube a 30 grados Celsius durante dos días sin agitación. Después de dos días, deberían comenzar a formarse colonias pequeñas de células en el fondo de cada pocillo transformado con éxito.

Para preparar el ensayo de Spatting, primero distribuya 200 microlitros de medio mínimo basado en OSE en cada pocillo de una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, mezcle cada pocillo de la placa de transformación aspirando y dispensando la suspensión celular ocho veces con una placa rápida.

Inocular cada pocillo de la placa con rafinosa con cinco microlitros de la mezcla celular procedente de la placa de transformación e incubar a 30 grados Celsius durante un día. Al día siguiente, deben estar presentes colonias pequeñas en el fondo de cada uno.

Realizaremos el ensayo de siembra en la campana; esterilice un portaobjetos de 96 puntas, replicador o "frogger" mediante flambado. Mezcle las colonias con un "frogger" y luego siembre las colonias en placas con medio selectivo. Después de la siembra, deje secar las placas en la campana durante cinco a diez minutos.

Incubar las placas a 30 grados Celsius durante dos a tres días. Aquí se muestran resultados representativos de una pantalla de sobreexpresión de plásmidos en levadura para identificar supresores y potenciadores de la toxicidad de TDP-43. TDP-43 es una proteína humana que se ha implicado en la patogénesis de la esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de Lou Gehrig. La expresión de TDP-43 en células de levadura provoca agregación y citotoxicidad.

Estas placas muestran colonias con un plásmido integrado de T DP 43 inducible por galactosa que también han sido transformadas con plásmidos de la biblioteca de expresión ORF de genes flex. Las colonias aquí aparecen de color rojo porque la cepa tiene una mutación que provoca la acumulación de un pigmento rojo. La placa de la izquierda contiene glucosa, que reprime la expresión de T DP 43 o de los plásmidos de genes flex.

La placa de la derecha contiene galactosa, que induce la expresión de TDP 43 y las OsF en los plásmidos del gen flex. La punta de flecha verde indica una colonia transformada con un plásmido que suprime la toxicidad de TDP 43, como lo indica un crecimiento más rápido y colonias más densas. La punta de flecha roja indica una colonia transformada con un plásmido que aumenta la toxicidad de TDP 43, como lo indica un crecimiento más lento y colonias menos densas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transformar una biblioteca de ADN plasmático de células evitadas.