Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

Este protocolo utiliza la interacción entre el poliovirus y los nanocuerpos que reconocen al poliovirus para demostrar un ensayo sencillo de captura por afinidad en fase líquida y cuantitativo. Principalmente, se utilizan perlas magnéticas recubiertas de cobalto para retener las proteínas marcadas y cualquier proteína marcada con radio que interactúe con ellas. Primero, mezcle las proteínas marcadas y etiquetadas e incube a temperatura ambiente.

Luego agregue perlas magnéticas que reconozcan la etiqueta, separe la fracción unida de la proteína marcada de la fracción no unida utilizando imanes. Luego mida la señal de la proteína marcada encontrada en la fracción no unida y determine la cantidad de proteína marcada presente en la fracción no unida. Los resultados de este ensayo de afinidad en fase líquida son extremadamente útiles cuando se analizan proteínas sensibles a la conversión conformacional.

Este ensayo de captura por afinidad en fase líquida puede proporcionar información sobre la interacción entre el poliovirus, nanoanticuerpos reconocedores y diferentes antígenos del poliovirus. El método también puede aplicarse a otras interacciones proteína-proteína, siempre que una proteína pueda ser marcada y la otra pueda detectarse. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando nos interesó investigar la interacción entre el poliovirus, nanoanticuerpos reconocedores y diferentes antígenos del poliovirus.

Dado que el poliovirus es sensible a la conversión conformacional cuando se une a una superficie sólida, el uso del LSA está limitado. Por lo tanto, debe preferirse un sistema basado en fase líquida. Un ejemplo de un sistema así basado en fase líquida, comúnmente utilizado en la investigación del poliovirus, es la microproteína.

Un ensayo de inmunoprecipitación. Aunque esta prueba ha demostrado su aplicabilidad, requiere la estructura cristalizada de un anticuerpo convencional, que está ausente en los nanocuerpos. Estos nanocuerpos, que son anticuerpos monocatenarios interesantes y muy estables, pueden ser fácilmente modificados con diferentes textos.

El sistema ampliamente utilizado His-tag muestra afinidad por iones bivalentes, como el níquel y el cobalto, que a su vez pueden recubrirse fácilmente sobre perlas magnéticas. Por lo tanto, desarrollamos un ensayo sencillo de captura por afinidad cuantitativo basado en perlas magnéticas recubiertas con cobalto.

Reese el stock de perlas magnéticas mediante vortex y transfiera 10 microlitros para cada muestra a un tubo; haga un pellet de las perlas utilizando un imán. Retire el sobrenadante para lavar las perlas. Añada 150 microlitros de tampón de unión.

Recupere las perlas utilizando un imán y elimine el sobrenadante tras un segundo lavado. Re suspenda las perlas en 40 microlitros de tampón de unión por cada muestra para controlar. Para el fondo en la muestra uno, prepare un pocillo sin virus radiomarcado, pero con un volumen igual de tampón de unión como control.

Muestre dos de 100 % de actividad radiactiva. Añada todos los componentes en un pocillo, excepto que sustituya el nanocuerpo por tampón de unión. Ahora añada 2000 cuentas por minuto del poliovirus marcado con S 35, cepa siete, tipo uno, en un volumen total de 80 microlitros de tampón de unión a todas las muestras.

Acepte el control. Muestra uno. Añada 10 microlitros de dilución de nanocuerpo a cada muestra.

Mezcle bien durante 10 segundos en un agitador e incube una hora a temperatura ambiente. A continuación, añada 40 microlitros de la suspensión de perlas magnéticas lavadas e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, separe las perlas mediante un imán y transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo para medir la radiactividad de cada muestra; transfiera 50 microlitros del sobrenadante a un frasco de conteo. Añada tres mililitros de mezcla de líquido de centelleo y lea en este aislamiento.

Contrarrestar la extracción de las perlas magnéticas usadas en un tubo utilizando agua y centrifugar a 500 ×g durante dos minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender las perlas en seis mililitros de hidróxido de sodio 0,5 molar. A continuación, distribuir la suspensión en varios tubos e incubar en un baño ultrasónico durante cinco minutos.

Después de centrifugar las perlas con un imán y eliminar el sobrenadante, añada un mililitro de solución de SDS al 2% a cada tubo, luego mezcle mediante vortex y envuelva con papel de aluminio durante cinco minutos. Ahora, recoja las perlas. Añada un mililitro de EDTA 0,2 molar, pH 7, a cada tubo e incube los tubos en un baño ultrasónico durante cinco minutos.

Luego, recolecte los gránulos, lave los gránulos con un mililitro de agua tres veces, seguido de un mililitro de solución de cloruro de cobalto 10 milimolar. Coloque los tubos en un agitador durante 10 minutos. A continuación, retire los gránulos mediante un imán y resuspenda en un mililitro de tampón de unión.

Lave dos veces en un mililitro de etanol al 20%. Finalmente, re suspenda las perlas en su volumen original de etanol al 20% para obtener perlas regeneradas en una concentración de 40 miligramos por mililitro. Corrija la radiactividad de fondo ajustando el control. Tome una muestra como valor de radiactividad del 0% y la muestra de control dos como valor de radiactividad del 100%.

Ahora, para cada muestra, calcule el porcentaje de radioactividad en el sobrenadante como una medida de la precipitación total del virus marcado con radioisótopos por el nanocuerpo. Este experimento evalúa la afinidad de PVSS 38 C y un anticuerpo específico para el poliovirus utilizando tres antígenos diferentes del poliovirus: antígeno nativo, antígeno calentado y subunidades de 14 s. Curiosamente, la radioactividad en el sobrenadante de las muestras que contienen subunidades de 14 s marcadas con radioisótopos disminuye con el aumento en la concentración del nanocuerpo PVSS 38 C. Esto indica un incremento en la cantidad de subunidades de 14 s del poliovirus unidas al nanocuerpo PVSS 38 C y, de forma indirecta, a las perlas magnéticas.

Dado que no se observa afinidad de pvs S 38 C por la forma antigénica N y la forma antigénica H del poliovirus, el nanocuerpo parece ser específico para la subunidad de 14 s del poliovirus. La afinidad del nanocuerpo hacia sus antígenos medida mediante este método es específica, ya que el nanocuerpo no relacionado NB uno no muestra reactividad contra las tres formas antigénicas del poliovirus.

Este sistema produce una alta reproducibilidad, tal como se indica en esta curva de respuesta a la dosis generada por diferentes investigadores en distintos días. Una vez dominado, este ensayo de captura por afinidad en fase líquida y confiable puede realizarse adecuadamente en menos de dos horas, incluyendo el reciclaje de las perlas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar este ensayo de captura por afinidad en fase líquida basado en perlas magnéticas al estudiar la interacción entre diferentes proteínas, especialmente cuando no pueden usarse sistemas basados en fase sólida.