Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general de este procedimiento es determinar el control genético de la formación de translocaciones mediante el plegamiento de cadenas sencillas en células diploides de levadura con brotamiento. Esto se logra primero inoculando cultivos con colonias individuales de un genotipo específico y cultivándolos durante la noche. El segundo paso del procedimiento consiste en inducir la formación simultánea de roturas de doble cadena mediante la endonucleasa Ho en dos cromosomas, añadiendo galactosa a los cultivos.

A continuación, se siembran diluciones de estos cultivos en medios selectivos y no selectivos. El paso final consiste en determinar la frecuencia de translocación mediante el conteo de colonias que aparecen en los medios selectivos y no selectivos. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el control genético de la formación de translocaciones por cadena sencilla, un arrodillamiento a través de cambios en la frecuencia de formación de translocaciones inducidas por ho en cepas de diferentes genotipos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las consecuencias de la exposición a radiación terapéutica en pacientes con cáncer, ya que las roturas de doble cadena del ADN y la formación de translocaciones son las consecuencias principales de este tratamiento. Para comenzar el procedimiento destinado a determinar las frecuencias de translocación inducidas, inocule entre 10 y 20 cultivos independientes de un mililitro de medio de glicerol-lactato Y con colonias simples del genotipo deseado e incube los cultivos durante la noche a 30 grados Celsius en un rotador. Cuando los cultivos hayan alcanzado la densidad celular deseada, añada galactosa al 20 % a los cultivos hasta una concentración final del 2 %. La galactosa inducirá la expresión de la endonucleasa ho, que dirigirá roturas de doble cadena en el alelo his3δ5' del cromosoma tres y en el alelo his3δ3' del cromosoma 15; incube durante cuatro horas a 30 grados Celsius en un rotador.

El siguiente paso es fundamental para el éxito del procedimiento. Es imprescindible una dilución y siembra cuidadosas de los cultivos. Si obtiene frecuencias de translocación suficientemente reproducibles como para permitir comparaciones estadísticamente significativas entre cepas de distinto genotipo, tras cuatro horas siembre la dilución adecuada de los cultivos en medio sin histidina, así como en YPD td, aproximadamente de 100 a 200 colonias por placa, e incube las placas a 30 grados Celsius durante dos o tres días.

Cuando aparecen las colonias, se puede determinar la frecuencia de translocación. Las eficiencias de siembra antes y después de la inducción de la expresión de la endonucleasa ho indicarán si la presencia o ausencia de cualquiera de los cromosomas translocados afecta la capacidad de sobrevivir a la formación de roturas de doble cadena (DSB). Que fragmentan una copia de ambos cromosomas tres y cromosoma 15 para determinar las eficiencias de siembra previas a la inducción.

Primero, retire una alícuota de células de cada cultivo nocturno y determine el número de células mediante el conteo con un hemocitómetro. A continuación, utilice una dilución adecuada para sembrar aproximadamente de 100 a 200 células en YPD e incube de dos a tres días a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias. Añada 20 % de galactosa a los cultivos restantes hasta una concentración final de 2 % e incube a 30 grados Celsius durante cuatro horas para determinar la eficiencia de siembra posterior a la inducción.

Retire un alícuota de células de cada cultivo tras cuatro horas de inducción y determine el número de células mediante un hemocitómetro. Siembre aproximadamente de 100 a 200 células en una placa usando una dilución adecuada en YPD e incube de dos a tres días a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias. Una vez que surjan colonias en las placas, puede determinarse la eficiencia de siembra. Los clones portadores de translocaciones putativas pueden examinarse mediante hibridación Southern.

Este procedimiento utiliza ADN genómico preparado a partir de una única colonia recombinante de his aislada de cada ensayo independiente. Se digiere aproximadamente cuatro microgramos de cada muestra de ADN con la endonucleasa de restricción BAM H1, se separan los fragmentos digeridos con BAM H1 en un gel de agarosa al 0,7 % y luego se transfieren a una membrana de nailon con carga positiva. La hibridación se realiza con una sonda marcada con P-32 obtenida por cebado aleatorio, utilizando un clon genómico de 1,8 KILOBASE BMH1 que contiene el gen HIS3. Se visualizan los fragmentos de ADN mediante autorradiografía o imagen fosforescente. Otra forma de analizar los clones portadores de translocaciones putativas es mediante el análisis de cariotipo cromosómico.

Primero se preparan los cromosomas a partir de recombinantes hiss positivos en tapones de agarosa, separando los cromosomas en un gel de agarosa al 1 % en un campo eléctrico homogéneo con fijación de contorno o CHEF a 14 grados Celsius. Se utilizan los siguientes parámetros: primer bloque a 14 grados Celsius, tiempo de conmutación de 72 segundos y 15 horas a seis voltios por centímetro; segundo bloque a 14 grados Celsius, tiempo de conmutación de 122 segundos y 11 horas a seis voltios por centímetro. Al finalizar la electroforesis, se visualizan los cromosomas tiñendo el gel con bromuro de AUM durante 30 minutos, seguido de irradiación con luz ultravioleta y revelado, y se transfiere el agua destilada a una membrana con carga positiva mediante acción capilar.

Bajo condiciones desnaturalizantes, se hibridiza con una sonda marcada con P 32 obtenida por cebado aleatorio con un clon genómico de 1,8 kilobases bam H uno bam H uno que contiene el hiss. Tres genes visualizan cromosomas mediante auto radiografía o imagen fosforescente. La frecuencia de translocaciones cromosómicas puede calcularse dividiendo el número de colonias fototróficas de histamina entre el número total de células viables determinado mediante siembra en YPD.

En este ejemplo, la frecuencia de recombinación calculada es de aproximadamente 3%. El ensayo para frecuencias de translocación estimuladas por ho puede realizarse utilizando cepas de diferentes genotipos para comparar las diferencias en la capacidad de reparar roturas de doble cadena por medio de cadena sencilla. Una inclinación como la mostrada en esta gráfica representativa. Las frecuencias de translocación obtenidas tanto selectiva como no selectivamente con el homocigoto nulo delta RAD 51 fueron estadísticamente diferentes de las obtenidas utilizando las condiciones correspondientes con la cepa silvestre, tanto antes como después de la siembra inducida.

Los rendimientos se determinan dividiendo el número total de células formadoras de colonias viables por el número total de cuerpos celulares en el cultivo, determinado mediante recuento con hemocitómetro, como se muestra en esta tabla antes y después del siembra post-inducción. Los rendimientos no fueron significativamente diferentes para las células de tipo salvaje, lo que sugiere que la presencia o ausencia de cualquiera de los cromosomas de translocación no afecta la capacidad de supervivencia. Formación de roturas de doble cadena (DSB).

Los clones portadores de translocaciones putativas pueden examinarse mediante análisis de hibridación genómica Southern blot. Aquí se muestra una representación gráfica de los cromosomas relevantes antes y después de la formación de la translocación. Los tamaños de los fragmentos de restricción que contienen las secuencias relevantes, generados por digestión con BAM H uno del ADN genómico de cepas parentales y recombinantes, se revelan en las hibridaciones mediante un fragmento de 1,8 kilobases de BAM H uno.

Sus tres clones genómicos se enumeran en pares de kilobases para el análisis por blot de Southern. El ADN genómico se digiere con la endonucleasa BMH I y se hibrida con una sonda de 1,8 kilobases marcada con P 32. La sonda HIS tres permite visualizar estos fragmentos diagnósticos.

Fragmentos de 0,8 kilobases de HIS tres delta 201,7 kilobases de hiss tres delta tres prima, 4 kilobases de T 3 15, 5 kilobases de T 15 tres y 8 kilobases de hiss tres delta cinco prima. La pista A es el diploide parental. La pista B es un recombinante con translocación no recíproca hiss más, y la pista C es una translocación recíproca his más.

El análisis recombinante de cromosomas mediante BLO también puede emplearse para examinar clones portadores de translocaciones. Los cromosomas intactos preparados en tapones de agarosa se separan mediante electroforesis CHEF y el gel se tiñe con bromuro de iridio y se visualiza bajo luz ultravioleta. Luego, los cromosomas separados se transfieren a nylon e hibridan con la sonda de 1,8 kilobases marcada con P-32.

Sus tres sondas permiten visualizar el cromosoma 15 intacto de 1,1 megabase, el cromosoma de translocación T15:3 de 15,8 megabases, el cromosoma de translocación T3:15 de 0,6 megabase y el cromosoma 3 intacto de 0,3 megabase. La línea A corresponde al progenitor desplegado. La línea B es A his más recombinante con translocación no recíproca, y la línea C es A his más recombinante con translocación recíproca.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la frecuencia de formación de translocaciones tras múltiples roturas de doble cadena inducidas por ho.