Microscopía fluorescente sin lentes en un chip

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una plataforma de microscopía fluorescente sin lentes y basada en un chip para la obtención de imágenes de objetos fluorescentes en un campo de visión extremadamente amplio. Para lograrlo, se coloca suavemente encima de una matriz de sensores optoelectrónicos, o un sensor CCDC moss, un filtro de absorción delgado y una placa de fibra óptica. Luego, se posiciona un chip microfluídico encima de la placa de fibra óptica. A continuación, se ensambla un prisma con el microchip mediante el uso de aceite de adaptación de índice.

La excitación fluorescente se logra a través de la cara lateral de un prisma romboide y la iluminación holográfica se realiza a través de la cara superior del mismo prisma. En definitiva, se pueden obtener imágenes microscópicas de alta resolución a partir de las imágenes fluorescentes adquiridas mediante la decodificación de las imágenes en bruto mediante algoritmos digitales. Si es necesario, los objetos fluorescentes decodificados pueden contarse automáticamente utilizando una interfaz desarrollada a medida.

Lente en el chip. La imagenología en general busca reemplazar los microscopios ópticos basados en lentes voluminosos por diseños más simples y compactos. Esta plataforma tecnológica emergente tiene el potencial de eliminar la necesidad de componentes voluminosos y costosos mediante el uso de nuevas teorías y algoritmos digitales de reconstrucción.

La lista de lentes en la plataforma de imagen en chip comprende varios componentes ópticos, incluyendo una matriz de sensores digitales, una fuente de iluminación incoherente, un prisma, un filtro de absorción y una placa frontal de fibra óptica, o un cono de fibra óptica. En esta plataforma, se pueden utilizar diferentes tipos de matrices de sensores para la detección de la señal fluorescente procedente de microobjetos diana. A efectos de este video, se utilizará un dispositivo acoplado por carga, y como fuente de luz incoherente se empleará, por ejemplo, un simple diodo emisor de luz para la excitación de fluorescencia.

Se utilizan dos métodos diferentes de filtrado de excitación en paralelo para crear el fondo de campo oscuro requerido, como se muestra en este diagrama. Primero, se emplea un prisma de vidrio o una semiesfera de vidrio para generar reflexión interna total o TIR en la superficie inferior del chip microfluídico que aloja las muestras de interés. En paralelo a esto, se utiliza un filtro de absorción económico para eliminar las luces de excitación dispersadas débilmente que no obedecen el proceso de TIR.

Tras el rechazo exitoso de la excitación mediante estos dos mecanismos, únicamente se adquiere en el plano del detector la emisión fluorescente de las muestras. A pesar de una apertura numérica de detección tan grande, las manchas fluorescentes crudas en la matriz de sensores se vuelven bastante amplias, lo que requiere ingeniería y un mejor control de la dispersión espacial de esta señal fluorescente. Se colocará una placa de fibra óptica entre los planos del objeto y del sensor como alternativa a una placa frontal convencional.

Una placa frontal de fibra óptica cónica, que tiene una densidad significativamente mayor de cables de fibra óptica en su cara superior en comparación con la inferior, puede utilizarse para obtener imágenes de mayor resolución mediante ampliación. Los chips microfluídicos empleados en esta plataforma se fabrican utilizando paredes de poli dimetil Siloxano dispuestas sobre portaobjetos de vidrio para crear los microcanales necesarios para iniciar el ensamblaje de la plataforma de imagen sin soporte. Primero, retire el cubreobjetos de la matriz de sensores optoelectrónicos utilizando un lápiz de vacío y coloque suavemente un filtro absorbente delgado sobre el área activa del detector.

Coloque una placa frontal de fibra óptica encima de este filtro de absorción. Luego, coloque el chip microfluídico fabricado directamente encima del arreglo de fibra óptica. A continuación, se ensambla un prisma de vidrio por encima del chip microfluídico utilizando aceite de adaptación de índice, de modo que el índice de refracción de la interfaz coincida con el índice de refracción del vidrio.

Conecte las fuentes de luz a los cables de fibra óptica mediante el uso de conectores FC. Uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento es la alineación de los componentes. Alinee cuidadosamente las distancias entre los componentes, la posición y el ángulo de la iluminación.

Finalmente, acerque la fibra de iluminación lateral al prisma y ajuste su ángulo para asegurar que ocurra reflexión interna total en la interfaz vidrio-aire correspondiente a los chips microfluídicos. Se pueden obtener imágenes del sustrato inferior, diversas células o modelos animales pequeños mediante esta plataforma integrada en el chip, pero para los fines de esta demostración se obtendrán imágenes de los glóbulos blancos. Para marcar los glóbulos blancos con un colorante fluorescente, primero mezcle aproximadamente 100 microlitros de sangre completa con alrededor de un mililitro de tampón de resuspensión de glóbulos rojos, incube durante unos tres minutos a temperatura ambiente y luego centrifugue la solución sanguínea.

Tras eliminar la capa superior utilizando una micropipeta, re suspenda la capa del sedimento en solución salina tamponada con fosfato para marcar el ácido nucleico de las células con un colorante fluorescente, agregue SYTO 16 a la suspensión re suspendida y luego incube la muestra durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Pasados los 30 minutos, centrifugue la muestra marcada. Elimine el sobrenadante para reducir el ruido de fondo debido a la emisión fluorescente de los colorantes no unidos.

Reese ha resuspendido la capa del pellet de glóbulos blancos en aproximadamente cinco mililitros de PBS. La muestra ya está lista para cargarse en el chip microfluídico para la imagen fluorescente sin lente en el chip. Antes de realizar la imagen de los glóbulos blancos, la plataforma de imagen debe calibrarse utilizando microesferas fluorescentes.

Prepare una muestra diluida de microesferas utilizando agua desionizada y la solución inicial de esferas. Con una jeringa de aguja fina, inyecte esta muestra inicial en el chip microfluídico desde el lateral de las paredes de PDMS.

Después de ensamblar los componentes para lograr la imagen fluorescente en el chip, adquiera imágenes en bruto de microesferas fluorescentes utilizando la interfaz personalizada desarrollada en LabVIEW a través de una computadora. Asegúrese de verificar que haya al menos 20 imágenes de microesferas fluorescentes aisladas distribuidas en todo el campo de visión. Guarde los datos de calibración, que se utilizarán posteriormente para calibrar y extraer la función de dispersión puntual de la plataforma de microscopía fluorescente sin lente.

Retire el chip microfluídico que contiene la muestra de microesferas fluorescentes y desacople el prisma de este chip. Inyecte la muestra de glóbulos blancos previamente preparada en otro chip microfluídico sin usar, desde el lado de las paredes de PDMS. Vuelva a ensamblar los componentes nuevamente con las mismas condiciones experimentales, especialmente en lo que respecta a las distancias y la potencia de excitación.

Adquiera las imágenes en bruto de los glóbulos blancos utilizando la vista personalizada del laboratorio con los mismos parámetros de software empleados para las microesferas fluorescentes. Los datos de calibración y las imágenes en bruto de los glóbulos blancos se utilizan luego para crear imágenes de mayor resolución en MATLAB mediante procesamiento digital. Aquí se muestran resultados representativos de imágenes fluorescentes en chip con lente de campo amplio de una mezcla que contiene partículas verdes fluorescentes de cuatro micrones y 10 micrones, con fines comparativos, microscopio 10 x.

Se proporcionan también imágenes objetivas que concuerdan bien con las imágenes fluorescentes sin lentes mostradas. A continuación, se presentan los resultados de imágenes fluorescentes sin lentes de campo amplio de una mezcla que contiene partículas fluorescentes verdes de 10 micrones y partículas fluorescentes rojas de 10 micrones. Las imágenes fluorescentes sin lentes muestran una buena coincidencia con las imágenes obtenidas con objetivo microscópico de 10x de las mismas muestras.

Esta figura proporciona una comparación de rendimiento entre la desconvolución de Lucy-Richardson y el muestreo compresivo basado en algoritmos de decodificación para la obtención de imágenes de diversos pares de microesferas de 10 micrones. La fila superior ilustra las imágenes fluorescentes brutas sin lente, en las que las imágenes insertadas muestran las comparaciones microscópicas de las mismas partículas, obtenidas mediante un objetivo de 10x. La fila intermedia muestra los resultados de la decodificación compresiva, mientras que la fila inferior ilustra los resultados de la desconvolución de Lucy-Richardson. DDCS y DLR se refieren respectivamente a las distancias entre centros, imágenes microscópicas, imágenes sin lente decodificadas por muestreo compresivo (CS) e imágenes sin lente desconvolutas por Lucy-Richardson (LR).

A continuación, se ilustra el procesamiento digital de imágenes en bruto con lente y menor fluorescencia. Se utiliza un algoritmo basado en muestreo compresivo para lograr una resolución espacial inferior a cuatro micrones, resolviendo pares de microesferas estrechamente empaquetadas con un diámetro de dos micrones. Los recuadros muestran comparaciones con objetivos microscópicos de 40 x, que coinciden muy bien con las imágenes fluorescentes decodificadas.

Aquí, D se refiere a las distancias centro a centro en las imágenes de microscopio. Mientras que DCS se refiere a las distancias centro a centro en la lente CS decodificada, imágenes menos fluorescentes. Esta figura muestra los resultados de la imagen sin lente de células blancas de la sangre marcadas fluorescentemente.

Las imágenes brutas sin lente se descodifican rápidamente mediante un descodificador basado en CS, lo cual concuerda muy bien con una imagen de microscopio convencional de la misma muestra adquirida con un objetivo de 10 x. Además de la obtención de imágenes si es necesario, los objetos fluorescentes descodificados también pueden contarse automáticamente utilizando una interfaz desarrollada personalizada para aplicaciones de citometría en chip. Aquí se ilustra una interfaz personalizada, automatizada para el conteo de objetos fluorescentes en matlab. Acabamos de demostrar el procedimiento para la microscopía fluorescente sin lente de células marcadas y microesferas a través de un campo de visión de ocho centímetros cuadrados.

Una plataforma de imagen comparada de este tipo con el decodificador compresivo rápido en segundo plano. Será bastante variable para aplicaciones de citometría de alto rendimiento, análisis de microelementos raros e investigación de células reales.