Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por "peroxidación" y "oxidativo" Huella de radicales hidroxilo

El objetivo general del siguiente experimento es determinar cómo se pliegan las moléculas de ARN utilizando la técnica de huella de radicales hidroxilo. Esto se logra mediante la marcación en los extremos, la purificación en gel y el prepliegue del ARN, lo cual asegura la integridad conformacional del ARN antes del plegamiento mediado por magnesio. En una etapa posterior, se mezclan los reactivos de Fenton para generar radicales hidroxilo, los cuales pueden escindir posteriormente el esqueleto del ARN de acuerdo con su accesibilidad al solvente. A continuación, los productos de escisión del ARN se separan mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida y se visualizan mediante autorradiografía.

Las integrales de las bandas se cuantifican mediante un software semiautomatizado de análisis de huellas. El objetivo final consiste en generar isotermas de plegamiento que reflejen la formación de la estructura terciaria del ARN. Esto se logra escalando las integrales de las bandas normalizadas a la saturación fraccional.

Las isotermas pueden ajustarse posteriormente a la ecuación de Hill. La principal ventaja del footprinting con hidroxilo es que se obtiene información sobre la estructura terciaria del ARN utilizando productos químicos económicos, ya que debido a su mayor actividad y tamaño reducido, los radicales hidroxilo son sondas ideales para distinguir entre nucleótidos accesibles al disolvente y nucleótidos enterrados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural del ARN.

Por ejemplo, ¿cómo emplean los ribosomas iones metálicos para alcanzar su conformación activa? La huella de radicales hidroxilo puede utilizarse para comprender los fundamentos de la especificidad y el reconocimiento del ARN. Además de revelar información sobre la estructura terciaria del ARN, este método puede emplearse para determinar los sitios precisos de unión de proteínas en moléculas de ARN o ADN.

Los principales desafíos de este método consisten en prevenir la degradación de la muestra por ribonucleasas y en optimizar la concentración de hierro para obtener la cantidad adecuada de escisión de ARN. Asimismo, el análisis detallado de los intervalos de las bandas puede resultar bastante complicado. La principal ventaja de este video es ayudar al público a comprender las etapas de planificación y la ejecución exitosa de un experimento de huella de radicales hidroxilo. Antes de comenzar este protocolo, prepare todos los reactivos para la huella tal como se describe en el protocolo escrito.

Junto con este video, se puede producir ARN en DFOs cuatro relacionados y marcados en el extremo como se indica allí. Purifique el ARN marcado radiactivamente mediante electroforesis en gel desnaturalizante. Recupere el ARN purificado mediante dos extracciones sucesivas de gel utilizando acetato de sodio 0,3 molar.

Luego precipite el ARN mezclando 0,5 mililitros de la solución acuosa con un mililitro de etanol. Incube la mezcla durante un minuto en hielo seco. Después de centrifugar la muestra, deseche el sobrenadante. Lave el pellet de ARN con etanol al 70%.

Elimine el sobrenadante tras una centrifugación adicional y seque el precipitado al vacío. A continuación, disuelva las muestras de ARN marcadas con P 32 purificadas. En 330 microlitros de tampón de reacción al uno por ciento, pipete 30 microlitros de la solución de ARN en un nuevo tubo de reacción.

Precipite el ARN con etanol y luego seque el pellet en vacío; una vez seco, este pellet puede utilizarse para generar la escalera de referencia según se describe en el procedimiento escrito para desnaturalizar la solución restante de ARN en tampón mediante calentamiento a 95 grados Celsius durante dos minutos. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos y realice una centrifugación rápida para recoger el condensado de vuelta en solución. Para comenzar el experimento de huella de proteasa, prepare 27 tubos de reacción con suficientes muestras para llenar una gel de electroforesis de 30 pozos.

Después de incluir los marcadores y el control digerido, determine las concentraciones finales de iones magnesio y hierro de modo que estén espaciadas uniformemente en una escala logarítmica a lo largo de varios órdenes de magnitud alrededor del punto medio de la titulación. La preparación de los iones magnesio en un tampón de reacción 1x se describe por separado en el texto. Incube la solución de ARN y las soluciones de iones magnesio a 50 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, mezcle 10 microlitros de la solución de ARN con 90 microlitros de la cantidad correspondiente de solución de iones magnesio y hierro.

Para alcanzar un volumen final de 100 microlitros, incube cada mezcla durante 30 minutos a 50 grados Celsius. Posteriormente, deje que las soluciones se equilibren a 25 grados Celsius durante una hora mientras ocurre el plegamiento del ARN. Mientras tanto, inmediatamente antes de iniciar la reacción de huella de radicales hidroxilo, prepare la mezcla de reacción fantasma según se describe en el protocolo escrito.

Prepare la reacción de peroxidación pipeteando dos gotas de dos microlitros cada una de ferro EDTA, ascórbato sódico y peróxido de hidrógeno en la parte superior interna del tubo de reacción que contiene la solución de ARN, de modo que las gotas no se toquen. Inicie la reacción de huella mediante mezcla vigorosa. Después de 15 segundos, detenga la reacción añadiendo 300 microlitros de etanol frío puro.

Gire los tubos de tres a cinco veces. Finalmente, precipite, lave y seque el pellet como se realizó anteriormente. Como alternativa a la reacción peroxidativa, la reacción oxidativa de hidroxilación se realizaría añadiendo cinco microlitros de la mezcla recién preparada de la reacción de Fenton a las muestras. Incube la reacción oxidativa durante 30 minutos a 25 grados Celsius.

Luego, agregue 300 microlitros de etanol frío puro para detener la reacción y mezcle invirtiendo los tubos. Precipite nuevamente. Lave y seque el pellet una vez finalizada la reacción peroxidativa u oxidativa.

Disuelva los pellet de ARN secos en ocho microlitros de tampón de carga para geles número dos. Confirme que el ARN marcado con P 32 se ha resuspendido utilizando un contador Geiger. Prepare un gel de secuenciación desnaturalizante de poliacrilamida al 8 % según los protocolos estándar. Utilizando un peine de 30 pozos, cargue las muestras, incluyendo dos referencias y un control de escisión.

Separar los fragmentos de ARN a 60-75 vatios durante dos horas y media. Exponer el gel seco a una pantalla fosfoensambladora durante la noche. Escanear la pantalla fosfoensambladora con un sistema de imagen para auto radiografía sin película.

Luego transfiera el archivo de la imagen del gel al ordenador para su análisis. Para comenzar el análisis de datos, abra Safa, un software de código abierto para el ajuste y cuantificación de bandas individuales. Cargue la secuencia de ARN como un archivo de texto con extensión .txt, seguido de la imagen del gel como un archivo con extensión .gel.

Defina las bandas y ajuste las intensidades de las bandas. Luego, elija una banda de referencia y realice una asignación de alineación del gel de bandas a nucleótidos en referencia al marcador de digestión de ARN T1. Cuantifique las intensidades de las bandas y utilice la función de gráfico de normalización/división por color para normalizar y asignar residuos potencialmente invariantes.

Guarde la salida como un archivo txt. SFA genera una hoja de cálculo que contiene columnas, que representan carriles en el gel, y filas que representan las integrales individuales de las bandas correspondientes al fragmento de ARN. Primero, deben identificarse los sitios de protección que muestran un cambio notable en la accesibilidad al disolvente mediante la comparación del perfil de protección derivado de la muestra sin ion magnesio con el perfil de la concentración final de ion magnesio.

Cuanto menor sea el valor, más protegido estará el nucleótido frente al ataque de los radicales hidroxilo, y viceversa. A continuación, cree curvas de transición de bandas, intensidades de nucleótidos individuales o grupos de nucleótidos frente a la concentración de hierro magnésico utilizando un formato de hoja de cálculo; escale individualmente estas transiciones a la función de saturación fraccional tal como se describe en la sección de texto de este protocolo. Como paso final, ajuste los datos a la ecuación de Hill.

Este análisis escala la transición a la saturación fraccional, determina el punto medio de la transición y proporciona una prueba fenomenológica de si una transición es sigmoidea. A continuación se presentan resultados representativos de experimentos de huella de radicales hidroxilo en el ARNr P cuatro P seis. Las isotermas se derivaron a partir de geles de secuenciación analizados mediante Safa y luego se ajustaron según lo descrito en la sección de análisis.

La imagen del gel indica que la escisión de fondo es mínima y que es posible la asignación de un solo nucleótido debido a bandas bien definidas en la pista de T. La fragmentación del ARN inducida por radicales hidroxilo está claramente por encima del fondo. La transición de bajos a altos iones de magnesio está selectivamente asociada con la disminución de la intensidad de bandas individuales y grupos de bandas, lo que indica la formación de ARN.

La protección de la estructura terciaria se refiere a nucleótidos individuales o grupos de nucleótidos contiguos cuyo corte cambia simultáneamente las intensidades de las bandas, las cuales se cuantifican y normalizan mediante análisis saffer. El resultado es un gráfico térmico que visualiza el grado de protección frente a los radicales hidroxilo. La transición de color describe el cambio en la accesibilidad tras la adición de hierro magnésico: el cambio de blanco a rojo indica nucleótidos más accesibles, mientras que el cambio de blanco a azul indica nucleótidos más protegidos.

Cada grado de sombreado está asociado con un valor numérico, que puede representarse como una curva de protección y analizarse mediante un modelo de unión, como la ecuación de Hill. En este ejemplo, la constante de disociación en equilibrio asociada a la protección 1 5 3 hasta 1 5 5 es aproximadamente el doble que el valor correspondiente de la protección 1 6 3 hasta 1 6 4. Este experimento de huella de radicales hidroxilo puede realizarse en un día y medio si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y una bata de laboratorio para evitar cualquier contaminación con ARN. Además, la concentración final de hierro depende del sistema experimental. Por lo tanto, recomendamos realizar un experimento de respuesta a la dosis antes de la huella genómica siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como la huella del radical hidroxilo resuelta en el tiempo, pueden realizarse para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿en qué momento crítico alcanzan las moléculas de ARN una conformación incorrecta o activa tras su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran interacciones terciarias moleculares inter e intermedias de los ácidos nucleicos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la formación de la estructura terciaria de las moléculas de ARN. No olvide que el catión y la etapa con fósforo son peligrosas; se recomiendan precauciones como el uso de guantes y gafas de protección, así como el uso de blindaje de plexiglás mientras se realiza este procedimiento.